（精品课件）RT-PCR和real time PCR 原理及步骤.ppt

绝对定量与相对定量的定义 * 绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 * 绝对定量通过标准品定量 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA PCR的产物 * 相对定量通过内标定量 内标（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 * 相对定量分析方法1 -ΔΔCt 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏 差在 5％以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： ΔCT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) ΔCT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值： ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 –ΔΔCT=表达量的比值 * 相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度 * 样品 ●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 ~ 2.0之间 ●DNA用量：0.05 ng –100 ng ●RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ●cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL * RT-PCR和real-time PCR 原理及步骤 * PCR定义 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。 多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。 * PCR原理 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水 * 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 RT-PCR原理 * 1.总RNA的提取。（试剂盒说明） RT-PCR基本步骤 Buffer dNTP混合物引物总RNA逆转录酶DEPC水 （试剂盒说明） 2.逆转录合成cDNA。 3.PCR及跑胶。 ddH2O10mM dNTP10×PCR bufferMgcl2上游引物下游引物模板cDNA Taq 酶 * Real-time PCR原理 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) *