3聚合酶链式反应技术及应用 医学分子生物学讲义.ppt

2020/4/27 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 63 目前最常用 优点：扩增效率高 特异性强 （杂交探针特异性结合靶序列，不与扩增 产物中的非靶序列结合） 可用于细胞制备和石蜡切片标本 缺点：操作复杂 2020/4/27 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 64 （七）定量 PCR （ Quantitive Polymerase Chain Reaction ， QPCR ） 以参照物为标准，对 PCR 终产物进行分析或对 PCR 过程进 行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量 PCR 。定量 PCR 的可行性定量一般是在 PCR 扩增的指数期 进行的。 定量 PCR 定量的理论依据： 理想的扩增结 果： Y=X × 2 n 其中 Y 代表 扩增产物量， X 代表 PCR 反应体中的原始模板数 n 为扩增次数； 理 论上 PCR 扩增效率为 100% ， PCR 产物随着循环的进行成指数增长，但实际上： DNA 的每一 次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈 2 的倍增长； 实际应为： Y= X(1+E) n ，其 中 E 代表扩增效率： E = 参与复制的模板 / 总 模板，通常 E≤1 ， E 在整个 PCR 扩增过程中不是 固定不变的。通常 X 在 1 ～ 105 拷贝、循环次数 n≤30 时， E 相对稳定，原始模板以相对固 定的指数 形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期； 2020/4/27 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 65 1 ． PCR 定量 DNA 一个或两个拷贝的特定靶序列的细胞株即是标准的一个理想 来源，也可使用含特定靶序列的质粒 DNA 作为对照，将待 检样品与一系列稀释的标准对照一起扩增，检测 PCR 产物， 即可推知靶序列的含量。 2 ． PCR 定量 mRNA (1)mRNA 相对定量－靶基因的扩增产物量与内源性对照的扩 增产物量的比值 (2) 竞争性 PCR 定量 mRNA (3)cRNA 标准曲线法定量 mRNA 2020/4/27 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 66 ? 荧光定量 PCR （ FQ-PCR ） 基于荧光能量传递技术 （ FRET ）， 是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当 供体荧光分子 的发射光谱与 受体荧光分子 的吸收光谱重叠， 并且两个分子的距离在 10nm 范围以内 时，就会发生一种非 放射性的能量转移，即 FRET 现象，使得供体的荧光强度比 它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却 大大增强（敏化荧光）。 荧光定量 PCR 技术 2020/4/27 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 67 ? 受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与 DNA 产量成正比，检测 PCR 过程的荧光讯 号便可得知靶序列初始浓度。 2020/4/27 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 68 实时荧光定量 PCR 在 PCR 反应体系中加入 荧光基团 ，利用荧光 信号累积 实时监测 整个 PCR 进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法 利用 对 与普通 PCR 的区别 普通 PCR 实时荧光定量 PCR 荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中 每一个循环扩增 产物量的变化 ，通过 Ct 值和标准 曲线的分析对 起始模板 进行定量 分析 PCR 扩增反应的 终点产物 进行定量和定性分析；无法 对起始模板准确定量，无法 对扩增反应实时检测 2020/4/27 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 69 ? 如何对初始模板定量 ? ? 荧光信号如何产生？ Real time PCR 实时监测系统 2020/4/27 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 70 实时荧光定量 PCR 原理定量原理 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、 Ct 值 如何对起始模板定量？ 通过 Ct 值和标准曲线对 起始模板 进行定量分 析 2020/4/27 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 71 实时荧光定量 PCR 原理 --------- 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标： 扩增循环数