细胞培养本方法.pptVIP

L/O/G/O _细胞培养的基本方法 圖E 细胞培养的基本概念 细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内 环境下,使其生长繁殖,并维持其结构和功能的 种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞 也可以是细胞群。 济 细胞培养的目的与用途 基础研究 (1)药物作用机理 (2)基因功能 (3)疾病发生机理 科学研究: (1)新药筛选:如药效研究,中药有效成分筛选等. (2)疫苗研究与开发:如肝炎疫苗,艾滋病疫苗,肿瘤疫苗等. (3)基因工程药物与细胞工程药物的研究与开发 (4)单克隆抗体制备 细胞培养主要的设施器材 设施:超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温 水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。 器材 玻璃器材 玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等,(现已较少使用)。 塑料器材 多孔培养板(6,12,24,48,%6)、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管 橡皮器材 橡皮制品(最好是硅制品)做各种瓶或试管的塞子、盖子 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 五、其他物品 纱布、注射器、针头、滤头 细胞培养的条件 (1)适宜的温度和PH 37℃,pH72~7.4 (2)气体环境 95%空气+5%CO2;适宜的湿度(无菌水不能干掉) (CO2细胞生长所必需的成分,pH值维持,最低不能低于1%。) (3)营养物质 N源、C源、无机盐、维生素、H2O,细胞培养基中含有 常用的细胞培养基:DMEM,RPMI-1640,BME,M199等 (4)无菌条件 紫外消毒、空气过滤、无菌滤头,高压灭菌、严格操作。 济 设施、器材、试剂实物图 济 培养细胞的分类 按照是否贴壁 贴壁细胞:大多数属此类细胞,如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质 细胞等 悬浮细胞:主要为取自血、骨髓、脾的细胞,如白血病细胞 按照传代次数 原代细胞:即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。(也有人把传代10次之 内的细胞统称为原代细胞。) 细胞系:指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如HeLa细胞、 CHO细胞等。 济 原代培养 原理:将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶) 螫合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培 养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖。 原代培养方法:消化培养法、组织块培养法。 济 原代消化培养法 (1)处理组织:用 Hanks液漂洗组织2-3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先 置于含有青链霉素的混合液中30-60分钟 (2)剪切:将组织切成2~3毫米大小的块,加入胰蛋白酶液,然后一并倒入培养皿中。 (3)消化:置于37℃温箱消化,每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和 组织的硬度而定。 (4)分离:用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞, 立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 (500~1000转/分)离心收集细胞,弃上清 (5)加入适量培养基重悬细胞,分装入培养瓶中,补足培养基 (6)培养:置于37℃,5%CO温箱培养。 济 原代组织块培养法 (1)剪切:用 Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污,剪成1mm3小块 (2)摆布:将组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每-25ml 培养瓶底可摆布20-30块 (3)轻轻翻转培养瓶,令瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,盖好瓶塞, 置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸。 (4)培养:从微箱中取出培养瓶,46度斜持培养瓶,向瓶底脚部轻轻注入培养液少 许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。 置温箱中静止培养。待细胞从组织块游岀数量増多后。再补加培养液。 济