《细胞生物学》实验.ppt

* 悬浮型 在培养时不粘附于支持物上，呈悬浮生长状态，如某些癌细胞和白细胞。细胞悬浮时胞体为圆形，其优点是细胞生存空间大,生长时间长，能繁殖出大量细胞。 细胞培养基 供给细胞营养和保证细胞生长的物质。 合成培养基　 天然培养基　 无血清培养基 合成培养基 是根据已知细胞所需物质的种类和数量严格配置而成的。由于成分清楚，通过调节各种成分的种类和数量，以观察细胞生物状态反应性变化，能了解细胞与外界环境的关系；了解细胞生存条件，并可诱导细胞定向分化等。应用广泛的有MEM，RPIM1640，DMEM等。 天然培养基 合成培养基中仍需加入一些天然成分，如人或动物的血清，血浆或胎汁等，否则细胞仍不能很好生长。血清成分中含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质，一般需加10～20%。添加血清，虽利于细胞生长，但血清中含有不明成分，对分析实验结果增加了困难。 无血清培养基 利用促细胞生长因子合成附加物，再与基本培养基混合，构成无血清培养基，一方面有良好的促生长效应，同时因其成分清楚，易于控制培养条件。无血清培养基仍在改良和完善之中。 实验用品 操作室 专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣间、缓冲间、操作间。内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必要设备，应具备紫外消毒、通风及温控设施。 超净工作台 原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器净化后，徐徐通过工作台，使工作台内构成无菌环境。 上装有紫外灯管。 CO2培养箱 为培养细胞提供恒定的温度和一定浓度的CO2 (5%),可维持培养液pH值稳定。 显微镜 倒置显微镜：观察培养细胞以了解细胞生长状态及是否发生污染。 冰箱 培养细胞用液、消化液、血清等都要储存于4摄氏度或更低温度条件下。用于细胞培养的冰箱应特别注意清洁，防止污染。 离心机 培养细胞时为了对细胞进行洗涤、调节细胞浓度等，需要制备细胞悬液并对细胞悬液进行离心处理。离心速度一般要求在每分钟1000转左右。 水纯化装置 细胞培养对水的质量要求较高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各种培养用液。玻璃器皿也要用重蒸水反复冲洗。 过滤装置 各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌消毒处理。微化滤膜滤器是目前应用最广泛的过滤装置。 细胞冷冻贮存器 细胞冷冻贮存具有经济、省力和较好保持细胞生物学特性的优点，目前各实验室主要使用液氮容器贮存细胞。 培养器皿 培养器皿包括各种规格的玻璃、塑料培养瓶，培养皿，吸管，离心管等等。 无菌操作的要领和要求 由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。根据实验要求准备好已消毒的所需用品，清点无误后放在超净工作台内。 超净工作台消毒 打开紫外线杀菌灯照射消毒20～30分钟，然后关闭紫外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台可保持无菌环境。 洗手 操作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用0.2%新洁尔灭或75%的酒精棉球擦拭。 火焰消毒 无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯。所有操作均应在近火焰处进行，所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒。 注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。 烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。　 吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼，否则会烧焦形成炭膜，再用时会将有害物质带入培养液。 操作 动作应准确敏捷，不应太快，以防空气流动增加污染机会。 不能用手触及器皿的消毒部分。　　 合理布局 右手使用方便的用品放右侧，左手使用方便的用品放左侧。酒精灯置于中央，打开的培养液、培养瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开口直立，易增加落菌机会）。 吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。 鸡胚成纤维细胞的原代培养和观察 实验基本原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究. 细胞体外长期生长的基本要求： 存活所必须条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。 严格控制无菌条件。 器材、用具： CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、恒温水浴箱、解剖剪、解剖镊、平皿、培养瓶、吸管、酒精灯、酒精棉球、标记笔 试剂 Hanks液、DMEM细胞培养基、胰蛋白酶 实验目的 1．学习和掌握原代细胞制备与培养的一