可溶性蛋白质含量测定教学内容.docVIP

考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量 一、原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（1-1000μg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。其结合物在室温下1h内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 二、材料、仪器设备及试剂 1、材料：小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料 2、仪器设备：分光光度计、研钵、烧杯、移液管 3、试剂 （1）标准蛋白质溶液：100μg·ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。 （2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。 三、实验方法及步骤 1、标准曲线的绘制 取6支具塞试管，按表加入试剂。混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100 图1 蛋白质质量数与吸光度值线性关系图（雷恩，2016） 2、样品测定 （1）样品提取：氨基酸含量测试结束后，剩余的样品提取液可以作为该实验的样品提取液，如果没有上述提取液，则按照下面的方法进行提取。 取鲜样0.5g，加入2ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。 （2）吸取样品提取液0.1ml，放入具塞试管中（每个样品重复2次），加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。 （3）结果计算（单位mg/g）样品中蛋白质含量=（C·VT）/（1000·VS·WF） 式中：C—查的标准曲线值（μg） VT—提取液总体积（ml） WF—样品鲜重（g） VS—测定时加样量（ml） 教师课堂管理的30个经典细节 1、第一印象很重要 第一节课,如果开头的一段话热情洋溢；板书的第一个字让学生为之赞叹；第一次朗读让学生为之感动；用丰富的表情和机灵的眼神吸引住学生；得体的幽默让孩子笑起来；充满爱意的一次抚摸让学生感到亲切；教学方法的变化让学生感到有趣，那么，你就成功了。如果这样，而且今后也不懈怠，我敢说，你绝对成功了。（著名特级教师于永正） 教师的第一节课，应该是拉近和学生的距离,培养学生对这门学科的兴趣,学生的兴趣有了，教师以后的教学就会顺畅些、圆满些。 2、用心记住每一个学生的名字 直呼其名相对于不指名道姓课堂效果会更好，把所授班级的学生座次表写出来，上课时放在讲桌上，这样做，有助于记住学生的名字，尽快地了解每个学生。(著名特级教师于永正) 教师上课时能熟记并且随时叫出学生的名字，学生就会感到获得了尊重，自然对教师产生了信任感、亲切感，这种情况下的教学效果往往会很好。 3、提前三分钟进教室