缺氧诱导因子1α诱导HepG2干细胞特性的研究.pdf

目录 摘要 （1） Abstract （3 ） 前言 （6 ） 1 材料与方法 （7 ） 2 结果 （14） 3 讨论 （18） 4 结论 （21 ） 参考文献 （22 ） 综述：缺氧诱导因子与肿瘤干细胞特性的研究进展 （24 ） 附录 （40 ） 攻读学位期间发表文章情况 （42 ） 致谢 （43 ） 个人简历 （44 ） 、 缺氧诱导因子1α诱导HepG2 干细胞特性的研究 摘 要 背景 肝癌（liver cancer ）在我国属于发病率较高的恶性肿瘤。肝癌发病比较隐匿，有 些患者在出现临床症状时已经错失手术根除的机会，随着近年来早期诊断和微创介入 治疗手段的不断进步，患者治疗后生活质量有所改善，但总体生存率仍没明显提高。 因此探明肝癌的发生、发展过程及相关发病机制和有效的治疗手段仍是当前肝癌基础 及临床研究的重点方向。研究人员发现在肿瘤组织内，有一部分细胞具有自我更新和 分化增殖潜能，有干细胞特性，因此将其命名为肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs ）， 多项研究证实这部分细胞是肿瘤起始和进展的根本原因。国内外多个学者已证明包括 肝癌在内的多个实体肿瘤均存在肿瘤干细胞，这一研究为从CSCs 角度探讨肝癌的发 病及有效治疗提供了新的思路。缺氧是实体肿瘤的普遍现象，同样在肝癌病理组织中 也观察到了很多缺氧区。氧缺乏可引起一系列分子生物学、细胞学及生理学的变化, 使肿瘤细胞在适应缺氧微环境的同时，增加肿瘤自身的侵袭性和对治疗的抵抗性，在 这个过程中缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)起着中枢纽带作用。 HIF-1α作为转录因子,可调控100 余种基因的表达，通过调节一系列下游靶基因及相 应蛋白产物增强细胞对缺氧的适应能力，以利于肿瘤的生长。肿瘤干细胞是肿瘤组织 中的一个细胞群体，也处在一个缺氧微环境中，HIF-1α是否会诱导肿瘤增殖与化疗 药物耐药，缺氧介导的治疗抵抗是否与肿瘤干细胞有关就成为我们的研究点。本研究 拟将HIF-1α高表达质粒导入HepG2 细胞系中，分析其是否与肿瘤干细胞相关，以期 为HIF- 1α为靶点的肝癌治疗提供理论依据。 目的 探讨HIF-1α对肝癌细胞HepG2 干细胞特性的影响，分析其对化疗药物的抵抗性。 方法 1 使用LIPO3000 试剂盒将质粒导入HepG2 细胞，并分成三组：HepG2 空白组、 1 空载体对照组（HepG2-pcDNA ）、实验组（HepG2-HIF-1α）。 2 利用G418 筛选成功导入HIF-lα质粒的阳性细胞。 3 采用qRT-PCR 试剂盒检测三组细胞HIF-lαmRNA 的表达水平。 4 采用蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot 技术检测HIF-1α蛋白含 量。 5 加入0、5、10、25 、50μmol/L 浓度抗肿瘤药物表阿霉素后采用MTT 法检测细 胞增殖及细胞活性，研究HIF-1α不同表达水平对其药效的影响。 6 选取对三组细胞影响差异明显的50μmol/L 的表阿霉素作用三组细胞，利用流 式细胞仪检测加入药物后细胞的凋亡情况。 7 利用流式细胞仪检测细胞标志物CD133 的表达情况。 结果 1 qRT-PCR 结果显示：HepG2-HIF-1α组HIF-1α mRNA 的量明显高于HepG2 组 和HepG2-pcDNA 组。 2 Western