RACO-1在食管鳞癌Hippo信号通路中的调节作用.pdfVIP

目 录 摘 要1 Abstract3 前 言6 材料与方法7 结 果16 讨 论28 结 论30 参考文献31 综述：YAP 在食管癌中的研究进展35 附 录46 攻读学位期间发表文章情况47 致 谢48 个人简历50 新乡医学院硕士学位论文 RACO-1在食管鳞癌Hippo 信号通路中的调节作用 摘要 背景： 食管癌是全球发病率排名前10位、致死率不断攀升的恶性肿瘤，呈明显地域分 布差异，是河南等地区发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一。发生在中国的食管癌 95%以上病理类型为食管鳞癌，这与西方绝大部分为食管腺癌迥然不同。目前食管鳞 癌具体的发病机制尚不完全清楚，最近的基因组测序显示Hippo信号通路的失调可能 是食管鳞癌进展的关键因素。我们在前期研究中，通过沉默食管鳞癌细胞系中的 RACO-1(RingDomainAP-1Co-Activator 1)可调节YAP 蛋白的稳定性，认为RACO-1 是Hippo信号通路的一种新的调节因子，因此，进一步探讨RACO-1调控Hippo信号 通路和YAP 蛋白转运机制，对提高食管鳞癌的早期诊断和靶向治疗具有重要意义。 目的： 探讨RACO-1在食管鳞癌中调节Hippo信号通路的作用机制，为食管鳞癌的早期 筛查和特异性治疗靶点提供新的思路。 方法： 1. 通过沉默食管鳞癌细胞系中的RACO-1，用实时定量聚合酶链式反应 （real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）和蛋白印记法 （Westernblot）方法检测沉默组细胞与对照组细胞中mRNA 水平和蛋白水平 表达情况，确定沉默效率。 2. 应用细胞划痕实验和Transwell实验评估RACO-1对食管鳞癌细胞修复能力和 迁移能力的影响。 3. 通过WST 实验检测细胞的增殖情况，明确RACO-1对食管鳞癌细胞增殖能 力的影响。 4. 通过免疫共沉淀实验 （Co-IP）及免疫荧光共定位实验明确RACO-1与YAP 在食管鳞癌细胞内的定位情况及两者的关联性。 5. 在食管鳞癌细胞系中沉默RACO-1，通过Westernblot 和qRT-PCR 实验检测 1 新乡医学院硕士学位论文 实验组与对照组中YAP 蛋白水平和YAP 靶基因mRNA 水平表达情况。 6. 通过Rescue 实验，观察沉默RACO-1之后食管鳞癌细胞侵袭和迁移与Hippo 信号通路改变的相关性。 7. 通过MG132、CHX及泛素化实验探讨RACO-1是否通过泛素化途径影响YAP 蛋白稳定性。 结果： 1. 沉默食管鳞癌细胞系中的RACO-1，结果显示其蛋白水平和mRNA 水平较对 照组相比明显下降 （P0.05），提示沉默成功。 2. 在食管鳞癌细胞系中沉默RACO-1后，行划痕实验观察到实验组与对照组相比 愈合速度增快，迁移能力增加 （P0.05），Transwell 实验观察到沉默组与对照 组相比迁移能力明显增加 （P0.05）。 3. WST 实验证明RACO-1的缺失抑制了食管鳞癌细胞的增殖速度。 4. 免疫共沉淀实验显示食管鳞癌细胞中RACO-1与YAP 存在内源性联系。免疫 荧光共定位实验表明RACO-1与YAP 在食管鳞癌细胞内存在共同的定位。 5. 食管鳞癌细胞中RACO-1的缺失增加了YAP 蛋白水平的表达，同时可以看到 YAP 的靶基因CTGF 和CYR61mRNA 水平升高 （P0.05）。 6. Rescue 实验结果表明沉默RACO-1引起的食管鳞癌细胞侵袭和迁移的增加可 以通过进一步的沉默YAP 来挽回。 7. MG132 实验、CHX 实验及泛素化实验表明RACO-1可以通过泛素化途径对 YAP 蛋白的稳定性起到调控作用。 结