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抗坏血酸过氧化物酶（ APX ）活性的测定 过氧化氢酶（ CAT ）活性测定 过氧化物酶（ POD ）测定方法 超氧化物歧化酶（ SOD）活性测定 小组第一次讨论结果： 一、抗坏血酸过氧化物酶（ APX ）活性的测定 1.原理 APX 是植物体内重要的抗氧化酶 , 主要功能是分解 H2O2, 此过程通过抗坏 血酸 - 谷胱甘肽循环来完成。此外 , 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢 , 而 抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。 因此，APX 被认为与果实的抗热性直 接相关。 2.所用方法 （1）采用碘液滴定法 : 称取新鲜材料 1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及 pH值6.0 的磷酸盐缓冲 液，迅速研磨成浆， 20 ℃下浸提 30 min ，中间摇动数次， 3000 r /min 离心后保 留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液 2 mL，20 ℃下反应 10 min 后，立即加入偏磷酸 1 mL ，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴 定剩余的抗坏血酸来进行测定， 加淀粉溶液几滴作指示剂， 以碘液滴定出现浅蓝 色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示 APX 的活性。每个处理设 3 个 重复。 （2）紫外吸收法： 称取 1g 芥蓝叶片组织，加入 1.6 mL 预冷的磷酸缓冲液（ PBS-K）（pH 7.8） 提取液（含 1 mmol ·L-1 AsA ，3 mmol ·L- 1β-巯基乙醇， 0.5 mmol L-1PMSF· ，2% PVP，1 mM EDTA ）。用液氮研磨，提取液于 4℃， 12000×g 离心 20 min ，上清 液用于酶活性的测定。 取 0.10 ml 酶液 （可视情况调整），加入 1.70 ml 含 0.1 mM EDTA-Na2 的 PBS （0.05 mol/L ，pH7.0），再加入 0.10 ml 5 mM 的 AsA ，最后加 入 0.10 ml 20mM H 2O2 ，立即在 20℃下测定 D290 （紫外）值在一定时间内的变 化，计算单位时间内 AsA 减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零） 。 APX 总活性 (uM ·g-1 min-1) =· △OD×Vr/ (A d××Vt ×W×△t) △OD：反应时间内吸光度的变化； △t ：反应时间， min ； -1 -1 Vr ：提取液体积， mL ； A ：消光系数， 2.8mM ﹒cm ； d：比色杯厚度， 1cm； Vt ：测定液体积， mL ； W ：样品鲜重， g。 二、 过氧化氢酶（ CAT ）活性测定 1.原理 过氧化氢酶（ CAT ）属于血红蛋白，含有铁，能够催化过氧化氢分解为水和 氧分子，此过程中起传递电子的作用， 过氧化氢既是氧化剂又是还原剂， 因此可 根据 H2O2 的消耗量或 O2 的生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量 （反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条 件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的 H2O2 的量。 2.CAT 活性测定方法 碘化钾滴定法： 本方法利用 H O