第七章 外源基因的表达.pptVIP

■选择标记基因 a ：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。 b ：显性选择标记（ G418 等），可采用各种类型酵母细胞作 为宿主细胞。 ■有丝分裂稳定区 来源于酵母染色体着丝粒（ centromere ）片断，能保证表 达载体在酵母细胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。 ■表达盒 表达盒是酵母表达载体的重要元件，包括启动子、分泌信号 肽序列、多克隆位点及终止子序列。 启动子： 保证转录的起始。 分泌信号肽序列： 引导目的基因蛋白分泌到细胞外。 多克隆位点： 供外源基因插入。 终止子： 保证转录在适当位置停止。 （ 3 ）酵母基因表达载体的种类 ■自主复制型质粒载体 该质粒含有酵母基因组的 DNA 复制起始区、选择标记、基因 克隆位点等关键元件。 酵母基因组 DNA 复制起始区： 能够在酵母细胞中自主复制。 基因克隆位点： 来源于大肠杆菌源质粒，如 pBR322 。 这类载体的 优点 在于：在酵母细胞中的转化率高，每个细胞拷 贝数可达 200 个 缺点 在于：由于缺乏酵母染色体着丝粒片断，在细胞分裂过程 中不能均匀的分配到子细胞中去，因而经过多代培养后，子细 胞中质粒载体的拷贝数迅速减少。 ■整合型质粒载体 该质粒载体不含有酵母 DNA 复制起始区，不能在酵母中进行 自主复制，但该质粒含有整合介导区，可以通过 DNA 的同源 重组将外源基因整合到酵母染色体上，随染色体一起进行复制。 ■着丝粒型质粒载体 该质粒载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建而成的， 增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件（着丝粒），因而能 保证质粒载体在细胞分裂时平均地分配到子细胞中去，同时提 高了质粒在宿主细胞中的稳定性。 ■酵母人工染色体 （ 4 ）酵母基因表达系统宿主菌 目前，作为外源基因表达的宿主酵母菌主要包括： 酿酒酵母、 巴斯德毕赤酵母、乳酸克努维酵母和多形汉森酵母 。 （ 5 ）在酵母中高效表达外源基因的策略 ■提高表达载体在细胞中的拷贝数 以多拷贝酵母内源性质粒为基础构建的多拷贝表达载体，是 提高表达载体在酵母中拷贝数的一个途径。但以上的多拷贝载 体在没有选择压力的情况下，可能难以保持其高拷贝数。 将外源基因整合到染色体上可维持外源基因在细胞中的稳定 性，然而在多数情况下会因为在细胞中的拷贝数较低而影响其 表达。 ■提高外源基因的转录水平 在构建表达载体时组入强启动子，如：酵母磷酸甘油酯激酶 基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶基因启动子，可提高外源基因 的转录水平。但外源基因表达的产物量过高也会对细胞形成伤 害。 ■选择合适的受体细胞系统 根据表达载体特性，选择合适的酵母受体系统。 2. 植物细胞基因表达系统 （ 1 ）植物基因表达载体的组成特性 大多数植物基因表达载体是以 Ti 质粒为基础构建而成的，其 组成包括启动子、 T-DNA 、终止子、内含子及选择标记基因 和报告基因。 ■植物基因表达载体的启动子 根据启动子的功能和作用方式，可分为 组成型启动子 、 诱导 型启动子 和 组织特异性启动子 等几类。 组成型启动子： 外源基因的表达大体恒定在一定水平，在不同 组织部位没有明显差异，没有时空特异性。一般采用花椰菜花 叶病病毒（ CaMV ） 35S RNA 的启动子、 Ti 质粒的胭脂碱合 成酶基因 (nos) 或章鱼碱合成酶基因 (ocs) 的启动子。 第七章 外源基因的表达 第一节 外源基因在原核细胞中的表达 1. 原核生物基因表达的特点 与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点： （ 1 ）原核生物只有一种 RNA 聚合酶（真核细胞有三种）识别 原核细胞的启动子，催化所有 RNA 的合成。 （ 2 ）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。 （ 3 ）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是 连续进行的。 （ 4 ）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细 胞的转录后加工系统。 （ 5 ）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对 基因产物的直接控制要慢。 （ 6 ）在大肠杆菌 mRNA 的核糖体结合位点上，含有一个转译 起始密码子及 16S 核糖体 RNA 3 末端碱基互补的序列，即 S- D 序列，而真核基因则缺乏此序列。 2. 原核表达系统的注意事项 从上述特点可以看出，欲将外源基因在原核细胞中表达，必 须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和 S-D 序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须 满足以下条件： （ 1 ）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的 酶系统合成外源蛋白。 （ 2 ）外源基因不能带有内含子，因而必须用 cDNA 或化学合 的基因，而不能用基因组 DNA 。 （ 3 ）必须利用原核细胞的强启动子和 S-D 序列等调控元件控 制外源基的表达