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小鼠肾脏细胞系的建立 细胞工程实验方案 设计题目：小鼠肾脏上皮细胞系的建立 设计者：班级 生物 1101 姓名 马聪冲 学号指导教师：陈晓明 日 期： 2013 年 11 月 11 日 西南科技大学 生命科学与工程学院 目 录 一、基本原理 （一）基本概念 二、准备工作 （一）实验所需试剂与材料 （二）实验所需的器材与设备 （三）基本用液的配置 （四）器材清洗、干燥与消毒 三、实验步骤 （一）取材 （二）原代培养 （三）传代培养 （四）细胞纯化 （五）细胞系的建立 （六）细胞冷冻保存 （七）冻存细胞的复苏 四、注意事项 小鼠肾脏上皮细胞系的建立 一 基本原理 动物细胞培养（ animal cell culture ）就是从动物机体中取出相关 的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜 的培养基中，让这些细胞生长和增殖。这个实验方案就是选取小鼠肾脏上皮利 用动物细胞培养技术建立细胞系。 二 准备工作 实验所需的试剂与材料 健康小鼠、火柴、酒精灯、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、 EDTA、稀盐酸、蒸馏水、 20%新洁尔灭、 70%乙醇、 D-Hanks 液、甲醛、高锰酸钾、甘油、滤纸、 0.22 滤膜、台盼蓝、培养基成分（见表） 实验所需器材与设备 培养皿、镊子、手术刀、手术剪刀、小烧杯、吸管、三角瓶、棉球、细胞计数板、滤器、毛刷、超净工作台、紫外灯、液氮、冻存管、溶液瓶、量筒、毛帕、脸盆、一次性手套 基本用液的配置 RPMI-1640培养基的制备与消毒 序 化合物名 含量 序 化合物名 含量 号 称 (mg/L) 号 称 (mg/L) 1 L- 精氨酸 290.00 21 硝酸钙 100.00 2 L- 门冬酰 50.00 22 无水硫酸 48.84 胺 镁 3 L- 门冬氨 20.00 23 无水磷酸 676.13 酸 二氢钠 4 L- 胱氨酸 65.15 24 氯化钾 400.00 二盐酸盐 5 L- 谷氨酸 20.00 25 氯化钠 6000.0 0 6 甘氨酸 10.00 26 葡萄糖 2000.0 0 7 L- 组氨酸 15.00 27 还原谷胱 1.00 甘肽 8 L- 羟脯氨 20.00 28 酚红 5.00 酸 9 L- 异亮氨 50.00 29 L- 谷氨酰 300.00 酸 胺 10 L- 亮氨酸 50.00 30 生物素 0.20 11 L- 赖氨酸 40.00 31 D-泛酸钙 0.25 盐酸盐 12 L- 甲硫氨 15.00 32 叶酸 1.00 酸 13 L- 苯丙氨 15.00 33 i- 肌醇 35.00 酸 14 L- 脯氨酸 20.00 34 烟酰胺 1.00 15 L- 丝氨酸 30.00 35 氯化胆碱 3.00 16 L- 苏氨酸 20.00 36 盐酸吡哆 1.00 醇 17 L- 色氨酸 5.00 37 核黄素0.20 18 L- 酪氨酸 23.19 38 盐酸硫胺 1.00 素 19 L- 缬氨酸 20.00 39 维生素 B 0.005 12 对氨基苯 20 1.00 甲酸 常用的培养基灭菌方法有化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤灭菌。因为化学药剂与培养基的一些成分作用，所以不采用；因为紫外线的穿透能力弱，所以仅用于表面消毒和空气的消毒。所以本次实验采用湿热灭菌 D-Hanks 液的配制： 1）溶解定容：将药品（NaCl：4.0g ，KCl：0.2g ，Na2HPO4·12H2O：0.06g ，KH2PO4： 0.3g ， NaHCO3：0.15g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解， 然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 500ml，摇匀即成新配制的 D-Hanks 溶液。2）移入溶液瓶内待消毒：将 D-Hanks 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内 8 磅消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 0.02%EDTA溶液的配置： EDTA0.20g、 Nacl8.00g 、 KCl0.20g 、葡萄糖 2.00g 、0.5%酚红 4ml，加入蒸馏水定容至 1000ml。10 磅 20min 高压灭菌，使用时调节 PH值到 7.4 。 胰蛋白溶液 : 1）用少量的 D-Hanks 液把胰蛋白酶粉末调成糊状 2）补足 D-Hanks 液，震荡摇匀，置 4℃冰箱内过夜 3）次日，等胰蛋白酶溶解后用滤纸过滤 4）滤纸再经过 0.22 滤膜除菌 5）分装小瓶放到冰箱内低温保存 3 左右 6）使用时，用 NaHCO调节至 PH7.0 0.4%台盼蓝母液： 称取 4 克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至 100ml，用滤纸过滤， 4℃ 保存。 4. 器