邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制.docxVIP

作者：敖红，林玲，阚海东，陈秉衡，张蕴晖【摘要】 目的 研究邻苯二甲酸酯类对大 鼠睾丸毒性作用的分子机制。方法运用RT-PCR方法观察邻苯二甲酸二丁酯 （DBP）对大鼠子代 不同发育阶段睾丸的苗勒氏管抑制物质 （MIS）、雄激素结合蛋白（ABP）和抑制素（inhibin） 表达 水平的影响，并采用ELISA法检测DBP^毒后大鼠睾酮水平的变化情况。 结果 与对照组比较， 各DB嗦毒组大鼠睾丸中 MIS表达差异无统计学意义，血清总睾酮水平差异无统计学意义， 但高剂量DBP（1000mg/kg）组睾丸支持细胞中 ABP^抑制素（inhibin） 的mRNAl达量显著减少， 且与睾丸损害呈时间-效应关系。结论环境内分泌干扰物 DBP可干扰大鼠发育过程中睾丸支 持细胞ABP和inhibin 的表达，其对性腺发育的影响可能是 DBP隹性生殖毒性的主要作用机 制之一。【关键词】 邻苯二甲酸酯类 近年来，塑料增塑剂邻苯二甲酸二丁酯 （DBP）被认 为是一种环境内分泌干扰物， 主要表现为雄性生殖发育毒性 （染毒大鼠睾丸萎缩、 附睾发育不 良、尿道下裂等）〔1, 2〕。本研究以DB叫邻苯二甲酸酯类（phthalates） 的代表物，观察DBP 对发育过程中F1代幼鼠睾酮（T）水平和雄激素结合蛋白（Androgen-binding protein,ABP） 、 抑制素（inhibin）、苗勒氏管抑制物质（MIS）基因表达影响，从调控雄性生殖系统的下丘脑 - 垂体-性腺轴角度探讨其生殖发育毒性的作用机制。 1材料与方法 1 1试剂 DBP（分析纯，纯度＞ 99 5% 上海溶剂厂）；吐温-80（化学纯，符合 Q/CYDZ-162-97,中国 医药集团上海化学试剂公司 ）；市售精制大豆油；大鼠睾酮酶联免疫试剂盒 （美国Biotech公 司）t旦点隆兔沆带决fd合蛋门 1（zona cocludens 1） , ZO 1）抗体（美国Zymed Laboratories 公司）和四甲基异硫停酸罗丹明（TRITC 山羊抗兔IgG）（北京中山生物医学有 限公司）。 1 2剂量设置及试剂配制 共设3个染毒组，DBP染毒剂量依次为50, 200, 1000mg/kg。另设1个溶剂对照组（0mg/kg）。准确称取100g DBP?入干净的烧杯中，按 1 : 2 比例加入吐11! 80和精制植物油，定容至500ml，为高剂量组；依次配制中剂量和低剂量组， 溶剂对照组用1 ： 2的吐温 80利精物油川蒸像水忙制而成，其中吐温 80和植物油的用量 同高剂量组。 1 3动物来源及染毒方法 1 3 1实验动物SPF级Sprague-Dawley 大鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），沪动合格证字 152号，NO.02-4-20，雌性100 只，体重（200 土 20）g，雄性50只，体重（300 土 30）g。 1 3 2饲养条件 清洁级动物 房，温度为（22 + 3）C，相对湿度为 50%^60%人工照明，12h光照，12h黑暗。动物食用标 准颗粒饲料，自由饮水。 1 3 3染毒方式 孕鼠灌胃染毒，自妊娠第1d（gestation day 1,GD1）至哺乳期结束〔出生后 21d（postnatal day 21,PND21）〕，每天1次，灌胃容积为 0 5ml/（100g ? bw）。停止染毒后，F1代雄鼠饲养至性成熟期 PND70d 1 3 4实验设计 清洁级SD成年大鼠，适应性饲养 1周后，按1 ： 2比例将雄、雌性大鼠合笼，合笼后每天清 晨固定时间做阴道涂片，显微镜下查涂片上有无精子以确定是否受孕。查到精子后，将受孕 大鼠取出，按体重随机分配至 4个实验组，查到精子的当天确定为妊娠第 0d（GD0）。2周交配 试验结束后，弃去雄鼠和未怀孕的雌性大鼠，每个实验组由 20只怀孕母鼠组成，自受孕第 2d（GD1）开始，灌胃染毒至哺乳期结束 （PND21）;每天称重一次，并根据体重调节染毒容积； 出生后4d（PND4）按照欧洲经济合作与发展组织 （OECD陕验指南（No.414）要求〔3〕，为保持仔 鼠营养的均衡性，进行窝标准化操作，即保持每窝 8只仔鼠（4只雌鼠，4只雄鼠），不足8 只的窝剔除，这样对照组、低剂量组和中剂量组各有 16窝，高剂量组有14窝。F1代雄性仔 鼠出生第1, 4和21d,每组选取5只动物，无菌环境中，迅速取下睾丸组织，立即置于放在 干冰上的无酶离心管中，-70 C保存至RN冲由提。[!--empirenews.] 1 4血清睾 酮水平的测定 采用ELISA方法测定PND70d大鼠的血清睾酮水平，睾酮酶联免疫试剂盒（美国 Biotech公司），按试剂盒说明进行操作。 1 5 RNA的提取 用TRIzol试剂一步法提取 睾丸组织总 RNA 1 6