绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)资料.docxVIP

绿色荧光蛋白 (GFP)基因的克隆和表达 背景知识 绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein ， GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔 肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需 底物或辅因子。 发色团是其蛋白质一级序列固有的。 GFP 由 3 个外显子组成， 长 2.6kb ；GFP 是 由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为 27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。 1996 年 GFP 的晶体结构被解出， 蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构， 长 420 nm ， 240 nm，由 11 个围绕中心 α螺旋的反平行 β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。 发色团是由其蛋白质内部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 . 实验一 质粒 DNA 的分离与纯化 一、实验目的 掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。该法用于 从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、 省时，提取的质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。 二、基本原理 质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今 为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到 200kb 。质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体 上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒 DNA 复制 中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格 限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的 控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达 10-200 个拷贝。当宿主细胞的蛋白 质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理） ，细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA 可继续 被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。 质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒 DNA 用人为的方法转化 进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药 基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表 型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。 质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒 DNA 分子。目前已有 许多方法可用于质粒 DNA 的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增； 菌体的收集裂解，质粒 DNA 的分离；质粒 DNA 的纯化。 1、 细菌的生长和质粒的扩增 从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松 弛型质粒（如  pUC  系列）来说，只要将培养物放到标准的  LB  或  2YT  培养基中生长到对数晚期， 就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒  DNA 。但对于严谨型质粒（如  pBR322 ）来说， 则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩 增。 2、菌体的收集、裂解和质粒  DNA  的分离 质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）  DNA  与质粒  DNA  之间的两种 主要性质差异： （ 1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒  DNA  大得多。（ 2）从细胞中提取得 到的大肠杆菌  DNA  主体是变性的线性分子，而大多数质粒  DNA  是共价闭合的环状分子。这里 主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入  SDS（十二烷基硫酸钠）和  NaOH  使菌体 裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁） 。此处理可破坏碱基配对， 故可使细菌的线状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。 当条件恢复正常时 （如 加入酸性的 NaAc 或 Kac 中和碱性 NaOH ），质粒 DNA 链迅速得到准确配对，重新恢复成天然 的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体 DNA 与变性蛋白质、 RNA 分子一起沉淀下来，而质 粒超螺旋分子仍滞留于上清中。 3、质粒  DNA  的提纯 对于小量制备的质粒 DNA ，经过苯酚抽提、 RNA 酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余 蛋白质及 RNA ，达到纯化的目的。 质粒 DNA 分子具