详细版实验一、RNA提取方法及原理.ppt

一、研究背景 1. RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。 c * 2 RNA分布 不同丰度 组织名称 样品量 总RNA含量 高丰度 肝脏 1mg 2-4μg 脾脏 1mg 心脏 1mg 中丰度 大脑 1mg 0.05-2μg 胚胎 1mg 肾脏 1mg 肺 1mg 低丰度 膀胱 1mg 0-0.05μg 骨 1mg 脂肪 1mg 高丰度 成纤细胞 105 0.5-1μg 人白细胞 105 中丰度 酵母 105 0.5-1.5μg 拟南芥叶片 1mg 0.2-0.5μg 低丰度 烟草叶片 1mg 0.05-0.1μg 玉米叶片 1mg c * 二、方法及原理 1 、 RNA的提取流程 （1）样本前处理 （2）细胞裂解 （3） RNA的纯化及获得 c * RNA提取流程－－ 样品前处理注意点 选择新鲜血液，不得超过4小时 选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞 选择新鲜组织，生长旺盛的组织 c * 可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞 然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间 去掉培养基，加入一定量TRNzol -70 ℃保存较长时间 推荐使用专门的RNA样品 储存液进行储存 液氮或加入RNase抑制剂中保存， 避免反复冻融 RNA提取流程－－ 样品前处理中如何保存样本 c * RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA 异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂 独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂 胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒 c * RNA提取流程－－ RNA的纯化及获得 RNA纯化要求 1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 2 排除有机溶剂和金属离子的污染 3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 4 排除DNA分子的污染 c * 2. RNA提取的注意事项 杜绝外源酶的污染 a.严格戴好口罩，手套。 b.实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 c.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 c * 阻止内源酶的活性 a.选择合适的匀浆方法。 b.选择合适的裂解液。 c.控制好样品的起始量。 c * 明确自己的抽提目的 a.任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 b.RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。  c * Rnase 污染的10大来源 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶 c * 复习核酸的提取方法 RNA的提取 苯酚水溶液提取 细胞破碎 → 匀浆等体积90％苯酚水溶液振荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖（水层）； DNA、Pro（苯酚层） 冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂 c * 复习核酸的提取方法 DNA提取 浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质 或：先用稀盐除去RNA－Pro，再用浓盐提取 也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA、Pro c * 复习核酸的提取方法 核酸的沉淀 DNA的等电点4-4.5，RNA的等电点2-2.5. 收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀。 在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。 c * Trizol?试剂提RNA的原理 Trizol?试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂 。Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。 c *