一步一步教你做转录组分析(HISAT--StringTie-and-Ballgown)最新.pdfVIP

一步一步教你做转录组分析（HISAT, StringTie and Ballgown） 该分析流程主要根据 2016 年发表在 Nature Protocols 上的一篇名为 Transcript-level expression analysis of RNA- seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown 的文章 撰写的，主要用到以下三个软件：HISAT (/software/hisat/index.shtml)利用大量 FM 索引，以覆盖整个基因组，能够将 RNA-Seq 的读取与基因 组进行快速比对，相较于 STAR 、Tophat ，该软件比对速度 快，占用内存少。 StringTie(/software/stringtie/)能够应用流 神经网络算法和可选的 de novo 组装进行转录本组装并预 计表达水平。与 Cufflinks 等程序相比，StringTie 实现了更 完整、更准确的基因重建，并更好地预测了表达水平。 Ballgown (/alyssafrazee/ballgown)是 R 语 言中基因差异表达分析的工具，能利用 RNA-Seq 实验的数 据(StringTie, RSEM, Cufflinks)的结果预测基因、转录本的差 异表达。然而 Ballgown 并没有不能很好地检测差异外显子， 而 DEXseq、rMATS 和 MISO 可以很好解决该问题。 一、数据下载 Linux 系统下常用的下载工具是 wget ，但 工具是单线程下载，当使用它下载较大数据时比较慢，所 以选择 axel，终端中输入安装命令：$sudo yum install axel 然后提示输入密码获得 root 权限后即可自动安装，安装完 成后，输入命令 axel，终端会显示如下内容，表示安装成功。 Axel 工具常用参数有：axel ［选项］［下载目录］［下载地 址］-s ：指定每秒下载最大比特数-n ：指定同时打开的线 程数-o ：指定本地输出文件-S ：搜索镜像并从X servers 服 务器下载-N ：不使用代理服务器-v ：打印更多状态信息- a ：打印进度信息-h ：该版本命令帮助-V ：查看版本信息号 #Axel 安装成功后在终端中输入命令：$axel /pub/RNAseq_protocol/chrX_data.tar.gz 此时在终端中会显示如下图信息，如果不想该信息刷屏， 添加参数 q，采用静默模式即可。 #数据下载后，进行解压：$tar–zxvfchrX_data.tar.gz 解压后 利用 tree 命令查看数据结构，它会以树状图的形式列出目 录的内容。整个数据的结构如下图所示： chrX_gtf 是 X 号染色体的注释文件 chrX.fa 是 X 号染色体的 序列文件 indexes 文件夹中是 HISAT 对于 X 号染色体的 index 文件，该文件是根据序列文件 chrX.fa 利用 hisat2- build 构建的，samples 文件夹中的 12 个 fastq 文件是英格 兰岛和约鲁巴住民的 X 号染色体的数据。 二、软件安装首先安装 bioconda，它是一个自动化管理生 物信息软件的工具，安装简单，且各个软件依赖的环境一 同打包且相互隔离，非常适合在服务器中搭建生信分析环 境。#下载和安装 miniconda$ wget https://repo.continuum.io/miniconda/Miniconda3-latest- Linux-x86_64.sh#下载完成后在终端中安装$bash Miniconda-latest-Linux-x86_64.sh 按照提示安装，完成后 $source ~/.bashrc #使以上的安装立即生效#输入以下命令 检验 miniconda 是否安装成功$ conda list 显示如下图信息 说明安装成功 然后利用 conda install 软件名+版本号安装软件即可，我们 需要安装 hisat2、stringtie 、samtools 三个软件，安装的命 令为：$ condainstall hisat2$ condainstall stringtie$ condainstall samtools 三、分析流程 1、使用 HISAT 将读段匹配到参考基因组上, 使用者可以提供注释文件，但 HISAT 依旧会检测注释文件 没有列出来