代谢工程改造解脂耶氏酵母产巴豆酸.pdfVIP

代谢工程改造解脂耶氏酵母产巴豆酸 巴豆酸是一种含有四个碳原子并且含有双键的有机羧酸,由于其分子内具有 碳碳双键的结构,使其化学性质较为活泼。巴豆酸主要在医药,化工等领域具有十 分重要的应用。目前巴豆酸的生产主要依赖化学合成法合成,以石油裂解所产生 的乙烯为原料之一,再经由一系列化学反应最终由巴豆醛转变为巴豆酸。 随着国际能源危机的加重以及环境的恶化,显然对于依赖化石燃料为基础的 工业从成本以及可持续发展的方面考虑,该产业都会受到一定程度的影响。所以 人类不得不通过其他方式来实现辅助或替代该产业。随着基因工程学手段的发展, 人类逐渐成功地从微生物中获取一系列的物质,首当其冲的模式生物也是人类目 前为止研究最为透彻的微生物就是原核生物的代表大肠杆菌。 虽然目前大多数的研究都是在该微生物中展开研究的,但是大肠杆菌因其具 有一定的致病性,且原核表达系统的自身的一些生物特性限制了其在工业生产中 大规模应用。随之诞生的酵母体系被认为是工业化生产中较为理想的表达体系模 式生物,真核生物相较于原核生物,因其自身表达系统的完整性使得真核生物表 达体系在工业化发酵产业上比大肠杆菌的表达体系更具优势。解脂耶氏酵母作为 一种新型的酵母表达体系越来越被广泛接受,因其较高的安全性(GRAS),使得该 酵母代谢产生的产物被广泛应用于食品,医药等领域。 同时解脂耶氏酵母自身具有脂肪酸代谢途径,对低pH值等极端环境的耐受 能力更强。综上,以解脂耶氏酵母为载体,是当前微生物发酵研究的主流方向之一。 本研究,在设计巴豆酸代谢途径之初,在丙酮丁醇梭菌体内发现其自身代谢产丁 醇的路径中具有合成巴豆醛的相关的路径和关键酶,并以此为基础继续挖掘,最 终成功在解脂耶氏酵母中构建了合成巴豆酸的合成路径。 通过气相质谱测定,培养基中含有巴豆酸。随后通过高效液相色谱测定,巴豆 酸的产量为62.24mg/L。随后,对构建的路径进行进一步的优化,通过过表达路径 中的关键酶,目的是实现过量积累巴豆酸前体物质以达到巴豆酸的高产,经过液 相测定产量达到123.49mg/L,产量提高近一倍之多。 随后继续对路径进行优化,将丙酮酸到乙酰辅酶A实现一步合成,降低了原 本需要是三步才能合成的每步的代谢消耗,使得更多的前体物质流向合成巴豆酸 的下游,最终经过液相测定巴豆酸的产量提高到了220.00mg/L,总体产量提升了 2倍之多。相较于化学法合成方式,本研究实现了在生物体内将糖类转化为巴豆 酸的过程,对底物和生产条件要求相对较低,产物对环境没有很强烈的危害;相较 于大肠杆菌的生产模式来说,本研究中所使用的菌种,适合高密度培养,且对低 pH环境耐受性相对较高,符合工业化生产的要求。