试验三血涂片的染色.docVIP

实验三 血涂片的染色 Staining of Blood Smear （一）瑞氏（Wright）染色法 实验原理 不同种类的细胞及细胞的不同成分对酸性及碱性染料的亲和力不同，因而瑞氏染色后各种血细胞显示出各自的染色特征。 试剂器材 1．试剂　瑞氏染液 Ⅰ液：包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上）600.0ml、甘油15ml。将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少半小时），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml甘油，密闭保存。 Ⅱ液：磷酸盐缓冲液（pH6.4~6.8）：包含磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.3g 、磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.2g、蒸馏水加至1000.0ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH值，塞紧瓶口贮存。如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。 2．器材　载玻片、吸耳球、染色架、显微镜。 操作步骤 （1）制片 见实验四血涂片制备。 （2）染色 待血涂片干透后，用蜡笔在两端划线，以防染色时染液外溢。然后将玻片平置于染色架上，滴加染液（I液） 3滴~5 滴，使其迅速盖满血涂片，约0.5min~ 1min后，滴加等量或稍多的缓冲液（II 液），用吸球对准血片吹气，使染液充分混合。 （3）冲洗 室温染色5min~10 min后用流水冲去染液，待干。 （4）结果观察 将干燥后的血片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体、尾交界处血细胞平铺的部分。在正常情况下，血涂片外观为淡紫红色，在镜下红细胞染为粉红色，白细胞胞浆能显示各种细胞的特有色彩，细胞核染紫红色，染色质清楚，粗细松紧可辨。 注意事项 1．未干透的血膜不能染色，否则染色时容易脱落。血涂片应在制片后1h内染色或在1h内用无水甲醇（含水量＜3%）固定后染色。 2．加染液应适量，过少则易蒸发沉淀，一旦染料沉积在血涂片上，则不易冲掉，使细胞深染不易检查。 3．染色时间的长短与染液浓度、染色时温度及血细胞多少有关。染色时间与染液浓度、染色时温度成反比；染色时间与细胞数量成正比。冲洗前，应先在低倍镜下观察有核细胞是否染色清楚，核质是否分明。更换染液时每批染色液和缓冲液均需试染，以掌握染色时间。 4．冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲洗，以防染料沉着在血涂片上。时间不能过久，以防脱色。冲洗完的血片应立放于支架上，防止剩余水分浸泡脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可用甲醇溶解，但需立即用水冲掉甲醇，以免脱色。 5．染色过淡，可以复染，复染时应先加缓冲液，创造良好染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。染色过深可用水冲洗或浸泡一定时间，也可用甲醇脱色。 6．血细胞中的各种有机物质，特别是蛋白质，对染色环境中氢离子浓度十分敏感。染色环境偏酸，增强伊红着色，红细胞和嗜酸性粒细胞偏红，细胞核呈淡蓝色或不着色；染色环境偏碱，增强天青着色，所有细胞呈灰蓝色，颗粒深暗。嗜酸颗粒呈暗褐，甚至棕黑色；中性颗粒偏粗，呈紫黑色。遇此种情况应更换缓冲液。 7．新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定时间，待美蓝逐渐转变为天青B后方可使用。瑞氏染液的质量好坏除用血涂片实际染色效果评价外，还可采用吸光度比值（ratio of absorption,RA）评价。瑞氏染液的成熟指数以RA（A659nm/A525nm）=1.3±0.1为宜。 思考题 血涂片瑞氏染色有哪些注意事项？