流式细胞基本知识教案资料.pdfVIP

此文档仅供收集于网络，如有侵权请联系网站删除 1、流式细胞仪上的 FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？ FL2-W 是只检测荧光的脉冲宽度， FL2- H 是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用， 用 于去除粘连细胞。 2、流式同型对照怎样选择？ 同 型对照（ Isotype Control ）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免 疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的 背景 染色。如果一抗是多抗， 可以用 an normal serum （与一抗相同的正常血清） （must be the same species as primary antibody ）。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining. 这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。 由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来 调整背景 染色。举个例子：比如检测一抗为单抗的 mouse anti rat CD11b ，clone OX-42 purified IgG ，那 么它的 isotype 是 mouse IgG2a， 所以可以用 purified （纯化的） mouse IgG2a 来做 OX-42 的同型对照（ Isotype Control ）。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。 同型对照：是指与 MoAb 相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染 色法，同型对照也应标记荧光色素，如 IgG1 FITC、IgG2 ａ、PE 等。主要考虑了细胞的自发 荧光、 FC 受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与 MoAb 所标记的荧光 色素、浓度、 F：P 比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相 同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与 MoAb 不相 匹配 的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。 3、流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙 .在文献及其他专业网站中都有测 定游离钙的方法，具体如下： （1） 钙荧光探针负载； （2 ）随机测定每管细胞悬液样品（以下简称样品）的单个细胞的荧光强度，记为 F 值。 （3 ）加入 10%Triton X 100，（破膜用）；加入 1 mmol/L 氯化钙， （问题所在），吹打均匀，孵 育 1~10min ，测定荧光即 Fmax 值。 （4 ）加入 EGTA，20 μl（钙螯合剂） ，孵育 1~10min ，激发波长 488nm 测定荧光， 即 Fmin 值。 这个过程中的氯化钙的作用如何， 请高人指点， 谢谢。 因 为正常血浆中 Ca2＋浓度是 1mM ，细胞外液的 Ca2＋对细胞内 Ca2＋有影响。加 0.1%triton 是增加膜通透性，使细胞外 Ca2＋进入细胞内，作 为最大值。加 EGTA是为了螯合 Ca2＋， 作为最小值 .生理环境中细胞内钙离子浓度远低于细胞外液 （大约 1：10000 ），细胞膜对钙的 通透性变化对细胞 内钙影响很大。 4、流式与 werstern 的区别，知道一些，不足之处请大家补充： 只供学习与交流 此文档仅供收集于网络，如有侵权请联系网站删除 （1）Western 是检测蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白；流式细胞术的 方法多用于检测细胞膜蛋白，