烟草瞬时转化.docVIP

本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法： 农杆菌介导的烟草瞬时转化： A、 实验步骤： 根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。 将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。 *估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。 3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。 4、用2ml Induction medium（without AS） 轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。 5、重复步骤4。 6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。 7、室温放置1~4小时 8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。 用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。 *使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。 B、试剂： Induction medium： MES-KOH PH 5.7 10nM MgCl2 10mM AS 200uM 推荐提前配制母液 1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌