微生物育种技术 项目二 诱变育种技术、单元五 工业菌种育种技术、任务一 利用紫外线诱变筛选淀粉酶高产菌株、微生物育种技术 单元五——项目三 霉菌种子选育技术.ppt

项目二 霉菌的分离和纯培养 一、无菌技术 无菌技术：是将微生物分离、转接及培养时防止被其它微生物污染的技术。 1、对使用的器皿及用具的灭菌 2、对培养基的灭菌 通常使用的方法有高温蒸汽灭菌和高温干热灭菌，效果达到无菌（不含任何微生物)。 3、无菌的环境 （1）在操作过程中的无菌要求：接种、分离过程的无菌效果（在火焰上部进行操作）。 （2）在超净工作台、无菌室和无菌箱中进行操作。使用甲醛、紫外线、75%的乙醇等进行预处理及其他的必要措施。 （3）如进行好氧培养需对空气进行处理，实验室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空气，工业中使用空气过滤器过滤空气。 二、霉菌的分离方法 1、平皿划线分离法 将灭好菌的琼脂培养基倒入培养皿中，凝固后用接种针取少量的需分离菌，在培养基的表面上进行划线，经培养后形成菌落。菌落在划线开始处较密集，在划线的结束处少，当有单个孤立的菌落时，就达到分离的目的。 划线的方法有：连续划线法、扇形划线法、方格划线法和平行划线法。 2、稀释分离法 （1）液体稀释法 （1）液体稀释法 首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物。如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物。 这种方法适合于细胞较大的微生物。 （2）稀释倒平板法 首先将待分离的样品进行连续稀释，取一定稀释度的样品涂布平板或者取一定稀释度的样品和熔化的营养琼脂混合（对于热敏感菌不适用），培养到平板上长出单一的菌落。对于涂布平板的样品菌落通常仅张在平板的表面，对于与营养琼脂混合的样品菌落通常出现在平板的表面和内部。 （3）涂布平板法 将经过稀释的样品滴加入已制好并灭好菌的培养皿表面，用灭好菌的涂布棒将菌液均匀 的涂抹在整个平板上，经培养长出单一菌落。具体分为两种方法：将0.1ml样品加入固体培养基表面，用无菌涂布棒均匀涂抹进行培养（适用于某些严格好氧菌）或者将样品加入到无菌的培养皿中，加入45~50 ℃固体培养基迅速混匀进行培养。 3、单细胞（单孢子）挑取法 4、选择性培养分离法 三、霉菌的培养 1、好氧培养和厌氧培养 好氧培养以空气为氧的来源。实验室的培养方法用平皿培养和斜面培养；工业生产时用自然对流和机械通风法来供氧；液体培养时微生物利用培养液中的溶解氧；液体三角瓶培养时利用摇床机达到供氧的目的；发酵罐培养时用通入无菌压缩空气达到供氧的目的。 厌氧培养是通过隔绝空气或驱除氧气的方法来实现的。实验室培养时，可将菌种接种到固体、半固体培养基的深层进行培养，同时加入还原剂；也可将厌氧微生物放入真空干燥器，抽出空气，并充入氮气或氮气和二氧化碳的混合气体。 2、分批培养和连续培养 分批培养：将微生物置于一定容积的、定量的培养基中培养，培养基一次性加入，不再补充和更换，最后一次性收获。分批培养的过程中菌体、各种代谢产物的数目与营养物的数目呈负相关性。当微生物生长及基质变化达到一定时，菌体生长则会停止。在发酵工业中可用中间补料或连续流加物料，使培养基中营养物质的浓度保持在适合菌体生长和有利于菌体积累代谢产物的环境中。 连续培养：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。 连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。 连续培养原理 连续培养和单批培养的比较 连续培养器 连续培养技术——恒化连续培养 连续培养技术——恒浊培养 连续培养技术——恒浊培养 恒浊器与恒化器的比较 连续发酵 连续发酵 缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。 连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月~ 1年。 固定化细胞连续培养 细胞固定化是通过包埋法、微胶囊法、吸附法等将细胞固定在载体的内部或表面 ，加入营养液及合适的培养条件，得到代谢产物。 优点：可提供高密度的细胞；减少细胞的流失，反复利用；简化细胞与代谢产物的分离工艺。 缺点：成本高；易污染；物质传递阻力大；只能用于细胞分泌型产物的发酵。 3、混菌培养 两种或两种以上的微生物的培养。通常是