微生物育种技术 单元五 工业菌种育种技术、项目三 杂交育种技术、微生物育种技术 单元五——项目三 （任务四）酵母种子选育技术.ppt

4．酶处理温度 5．酶处理时间 6．渗透压稳定剂 灭活原生质体融合技术在育种中的应用 灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活处理单一亲株或双亲株的原生质体，使之失去再生能力，经细胞融合后，由于损伤部位互补可以形成能再生的融合体的过程。 ——酵母菌基因重组育种 基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。 一个完整的基因克隆过程包括以下步骤 １、获得待克隆的DNA片段（基因）； ２、目的基因与载体在体外连接； ３、重组DNA分子导入宿主细胞； ４、筛选、鉴定阳性重组子； ５、重组子的扩增与／或表达。 酵母分离纯化 （1）平板划线分离法：最常用的方法 １、倾注平板法 首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40~50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。（图2－9） ２、涂布平板法 首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。（图2－9） 连续稀释法 涂布平板法 Spread plate method Pour plate method 观察菌落特征 在无菌环境中倒平板 平板制作过程 ４、富集培养法 富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。 ５、厌氧法 在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。 三、培养方法 微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、ＰＨ等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。 1）根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。 好氧培养：也称“好气培养”。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。 厌氧培养：也称“厌气培养”。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法： 　a.降低培养基中的氧化还原电位：常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养基中，便可达到目的。有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。 　b.化合去氧：这也有很多方法，主要有：用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。 　　 c.隔绝阻氧：深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。 d.替代驱氧 用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体驱代氧气。 ２）根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类。 　固体培养：是将菌种接至疏松而富有营养的固体培养基中，在合适的条件下进行微生物培养的方法。 　液体培养：在实验中，通过液体培养可以使微生物迅速繁殖，获得大量的培养物，在一定条件下，还是微生物选择增菌的有效方法。 根据菌落及培养特征鉴别微生物的类型——平板上细菌菌落的形状 根据菌落及培养特征鉴别微生物的类型——琼脂斜面划线生长的形状 肉汤培养生长的特征 思考题 一、问答题 简述产淀粉酶菌株的筛选过程。 二