转基因动物遗传修饰策略和载体设计.pdf

转基因动物遗传修饰策略和载体设计 朱焕章 复旦大学遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室 转基因动物遗传修饰策略和载体设计 • 转基因表达载体设计策略 ►一般转基因表达载体设计 ►条件性转基因表达载体设计 ►细菌人工染色体(BAC)转基因表达载体设计 • 基因打靶策略和载体设计 ►完全基因剔除(knockout) ►条件性基因打靶(conditional gene targeting) ►Knock in ►Gene trap ►大片段染色体重排和删除 置换型载体设计原则 • 同源臂为5-8KB • 正选择标记框应插在靶基因上游的外显子内 • 应避免将正选择标记框插入到靶基因外显子两 个编码密码子之间 • 若靶基因太小或者外显子太大应删除整个靶基 因 • 若用PCR方法筛选中靶的棵隆，打靶载体短臂 应为0.5-2KB • 打靶载体在转染细胞前要线化，因而在同源臂 外侧至少有一个单切酶点 插入型载体 • 又称O型载体，在打靶过程中，整个载体序列通 过同源重组插入到基因组序列中，使靶基因发生 突变。 • 与Ω型载体结构元件基本相同，主要不同点在于 线性化位点不同，置换型在同源序列外测，而插 入型在外同源序列内部 • 插入型打靶效率比置换型高5-10倍，但前者易形 成拓扑构型，因而人们更倾向于置换型 设计插入型载体原则 • 同源臂为5-8KB • 正选择标记框可在同源区内或外 • 若载体中同源序列仅含有一个外显子应避免将正选择标记 框插入到靶基因外显子上 • 若靶基因太小或者外显子太大应删除整个靶基因 • 打靶载体在转染细胞前要线化，因而在同源臂上至少有一 个单切酶点 • 不要选用基因的第一个和最后一个外显子序列作为打靶载 体的插入点 Tissue-Specific Knockout Transactivator Floxed Responder X Conventional ES-derived mouse Transgenic 12 kb Albumin Promoter enhancer Cre Floxed allele: “normal” expression Cre expression in liver Liver Liver-specific gene deletion Elsewhere “Normal” expression 精细突变引入基于Ｃre/loxP Knock-in载体设计及重组 转基因动物遗传修饰策略和载体设计 • 转基因表达载体设计策略 ►一般转基因表达载体设计 ►条件性转基因表达载体设计 ►细菌人工染色体(BAC)转基因表达载体设计 • 基因打靶策略和载体设计 ►完全基因剔除(knockout) ►条件性基因打靶(conditional gene targeting) ►Knock in ►大片段染色体重排和删除 ►Gene trap 人类遗传病 (由遗传物质改变引起的人类疾病) 1.单基因遗传病 2.多基因遗传病 3.染色体异常遗传病 1.单基因遗传病 (由一对等位基因控制的遗传病) 显性致病基因引起 并指 软骨发育不全