转基因动物遗传修饰策略和载体设计2.pdf

转基因动物遗传修饰策略和载体设计 朱焕章 复旦大学遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室 • 反向遗传学（reverse genetics）：由转基因 体系发展而建立的,则先在体外使基 因某一片段发生突变，然后导入基因组， 从而研究基因结构和功能关系以及建立人 类遗传病动物模型．这种从特定基因的改 造到整体动物的表型分析的研究思路称为 反向遗传学 • 传统遗传学/正向遗传学 (forward genetics):是从具 有特定异常病理表型的突变小鼠开始， 通过染色体定位和分子克隆的方法，最 终克隆导致特定表型的基因组突变位点， 从而建立某一基因与相应生物学现象之 间的关系． A －1型短指（趾）症 贺林: 2000年将A－1型短指（趾）症的致病基因定位于2号染 色体长臂的特定区域；2001年，在国际上首次发现并克隆了导 致A－1型短指（趾）症的IHH基因。 此后8年，贺林带领的科研团队与香港大学紧密合作，成 功培育出A－1型短指（趾）症的基因打靶小鼠模型。科研人员 通过对小鼠模型“体内”和细胞的“体外”研究，结果发现A －1型短指（趾）症致病基因IHH的点突变，造成骨骼组织中 “刺猬”（Hedgehog）信号能力和信号范围发生改变，最终 导致中间指（趾）节的严重缩短，甚至消失 • 基因的功能研究可分为: gain-of-function:转基因表达载体 loss-of-function:基因打靶 转基因动物遗传修饰策略和载体设计 • 转基因表达载体设计策略 ►一般转基因表达载体设计 ►条件性转基因表达载体设计 ►细菌人工染色体(BAC)转基因表达载体设计 • 基因打靶策略和载体设计 ►完全基因剔除 ►条件性基因打靶 ►Knock in ►Gene trap ►大片段染色体重排和删除 转基因表达载体设计策略 确定一个转基因小鼠技术来进行研究的课题后,如 何考虑构建一个用于建立转基因小鼠的表达载体呢? • 需要了解目的基因本身表达的组织细胞分 布 • 在不同病理和生理状态下, 目的基因表达譜 改变的特点 • 选择不同启动子 • 例子:肿瘤基因研究 过表达/点突变—CDNA-载体(肿瘤发生组 织特异性启动子)—TgM-观察小鼠相应组织 器官的病理变化过程． Basic Transgenic Construct Promoter - to Intron - Transgene - expressing cDNA for gene of interest ,PolyA drive cell-specific, often with or without mutations, or containing sequences from tissue-specific, or provides other organisms etc... time-specific essential expression regulatory elements Useful for: • Studying gene expression profiles • Overexpression • Dominant negative, insertional/point mutants • 显性负效应(dominant negative effect)： 某些信号转导蛋白突变后不仅自身无功能 ，还能抑制或阻断同一细胞内的野生型信