兽药检测技术 细菌内毒素检查技术 细菌内毒素法标准操作规程.docVIP

细菌内毒素检查法标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2015年版一部附录中细菌内毒素检查法—凝胶法 1.2 供试品细菌毒素限值的确定 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K／M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EＵ／mg、EＵ／Ｕ表示。 Ｋ为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／kg／h表示。其中注射剂，Ｋ＝５EU／kg／h；放射性药品注射剂，Ｋ＝2.5EU／kg／h；鞘内用注射剂，K=0.2EU／kg／h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml／kg／h、mg／kg／h、U／kg／h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品注说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算： MVD=C·L∕λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU∕ml表示时，C等于1.0ml∕ml；当Ｌ的单位以EU/mg或EU/U表示时，Ｃ为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取１，可计算供试品的最小有效稀释浓度Ｃ：λ∕L λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度。 1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 1.5 药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。 1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照﹑阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则实验结果无效。　 2 实验材料及用具 仪器 天平、电热干燥箱 、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）、水银温度计或酒精温度计（精度在1℃以下）、旋涡混合器、 移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝胶管（10mm×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 试剂 鲎试剂、 细菌内毒素国家标准品和细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水。 3 实验准备 3.1 玻璃器皿的洗涤 将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留的洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。 3.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素 玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1小时。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温，在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。 ４ 凝胶法操作方法 4.1 鲎试剂灵敏度复核 4.1.1 实验操作 4.1.1.1 内毒素标准溶液的制备 取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，起开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。 按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程参见标准品使用说明书）。 若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装、保存。若为细菌内毒素工作品，为一次性使用。 4.1.1.2 待复核鲎试剂的准备 取规格为0.1ml∕支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1ml分装到10mm×75mm凝聚管中，要求至少分配18管备用。 4.1.1.3 加样 将以充分溶解的待复核鲎试剂1