鸟氨酸氨基转移酶和氨甲酰磷酸合成酶1在肺癌中表达的研究及生物.doc

鸟氨酸氨基转移酶和氨甲酰磷酸合成酶1在肺癌中表达的研究及生物信息学分析 作者：周丹菲；杨拴盈*；李维；明宗娟；蒋梅花；张玉萍；刘晓丽；牛泽群；侯彦丽 单位：西安交通大学医学院第二附属医院 邮编：710004 通讯作者：杨拴盈，教授，博士生导师，E-mail： yangshuanying66@163.com；电话摘 要 目的：检测鸟氨酸氨基转移酶（Ornithine Aminotransferase, OAT）和氨甲酰磷酸合成酶1（Carbamoyl-phosphate Synthase 1, CPS1）在肺癌中的表达；探讨OAT和CPS1蛋白表达与肺癌患者临床病理特征的相关性；对OAT和CPS1进行生物信息学分析并预测其相互作用蛋白。 方法：采用RT-PCR的方法比较A549和16HBE细胞间OAT和CPS1mRNA水平的差异；采用免疫组化的方法，对58例肺癌组织和17例癌旁肺组织中OAT和CPS1蛋白表达水平进行比较，进一步通过χ2检验或Fisher确切概率法探讨两种蛋白质的表达和肺癌患者临床病理特征的相关性；利用数据库和软件，分析OAT和CPS1蛋白的生物信息学特征并预测其相互作用蛋白。 结果： 1、OAT和CPS1mRNA在A549中较16HBE中相对含量低，两者差异分别为2.85倍和1.42倍，有统计学意义。 2、OAT和CPS1蛋白在癌旁肺组织中均无表达，在肺癌组织中表达率分别为82.76%（P＜0.05）和6.90%（P＞0.05）；肺腺癌中OAT蛋白表达高于肺鳞癌，差异有统计学意义；而OAT蛋白表达和性别、年龄、有无淋巴结转移、肿瘤直径及TNM分期无明显相关；CPS1蛋白表达和患者临床病理学特征无明显相关。 3、OAT蛋白的生物信息学分析提示其为定位于线粒体的、高度保守且稳定的亲水性蛋白，包含Aminotran-3结构域，可能存在多个丝/苏氨酸磷酸化位点，在信号转导、转录和分子转运等方面发挥一定的作用。CPS1蛋白也是一种较为稳定的亲水性蛋白，主要定位于线粒体，少量存在于胞浆和内质网中，可能包含有催化氨基甲酰磷酸合成、ATP结合及反应调节作用的结构域和多个丝/苏氨酸磷酸化位点，在信号转导、转录和分子转运等方面发挥一定的作用。 4、通过生物信息学分析和预测，分别筛选出54和32种可能与OAT和CPS1存在相互作用的蛋白质，对这些蛋白质进一步进行GO注释和信号转导通路分析提示，TNF和TRAF6这两种蛋白参与了NF-κB信号通路。Raf1和Sp-1这两种蛋白参与了MAPK信号转导通路。 结论： 1、OAT可能在肺癌的发生和发展中发挥重要作用，有望成为肺癌的诊断标志物和治疗的新靶点。 2、CPS1可能与肺癌的发生和发展关系不大。 3、初步了解了OAT和CPS1的生物信息学特征和相互作用蛋白。 关键字：肺癌；鸟氨酸氨基转移酶；氨甲酰磷酸合成酶1；表达；生物信息 肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，根据世界卫生组织GLOBOCAN项目公布的2008年数据显示：肺癌每年新发病例数达160万，占所有恶性肿瘤的13%；肺癌每年所致死亡例数达140万，占所有肿瘤死亡数的18% []。因其缺乏特异性的症状和体征，往往难以在疾病的早期发现和确诊，肺癌被认为是目前世界上对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤[]。70%-80%肺癌患者确诊时已是肿瘤中晚期，存在淋巴结或肺内及远处转移，虽然目前的治疗方式不断进步和发展，但是肺癌患者的预后仍不尽人意。临床研究表明[]，原位癌治愈率接近100%，Ⅰ期肺癌患者的5年生存率达60%~90%，而Ⅲb和Ⅳ患者的5年生存率仅5%~20%。由此可见，改善患者预后、降低肺癌死亡率的关键在于早期诊断和早期治疗。应用蛋白质组学的方法筛选肺癌早期诊断标志物和治疗靶点是近期研究的热点，但是至今尚无理想的生物标志物。 材料与方法 一、实验材料 1、细胞及组织来源：人肺腺癌细胞株A549来自西安交通大学中心实验室保存；人正常支气管上皮细胞株16HBE购于中国医学科学院肿瘤细胞库；58例肺癌组织标本取自西安交通大学医学院第二附属医院2006-2011年手术病例，其中17例同时收集癌旁＞5cm处肺组织标本，其中男性38例，女性20例，鳞癌35例，腺癌20例，小细胞肺癌2例，非典型类癌1例，29例无淋巴结转移，29例存在淋巴结转移，平均年龄为58.3±10岁。所有入选病例术前未经放、化疗，无肝硬化、自身免疫病等合并症，术后经病理确诊为肺癌。组织标本经福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片备用。 2、主要试剂：RPMI1640培养液、胎牛血清、青-链霉素溶液（美国Hyclone）；0.25%胰蛋白酶溶液（上海碧云天）；RNAfast200总RNA极速抽提试剂盒（上海飞捷）；RevertAid? Fi