产木聚糖酶嗜热真菌鉴定基因克隆及米曲霉表达系统构建.pdf

摘 要 木聚糖酶是一类木聚糖降解酶系，在食品、饲料领域应用广泛。但目前该酶的应用 受到酶活低、热稳定性差、不安全等因素的制约。本文通过将食品级米曲霉系统和产木 聚糖酶嗜热菌株有机结合起来，为木聚糖酶基因工程方法获得酶活高、工业成本低、安 全的木聚糖酶研究提供新的思路奠定基础。主要实验结果如下： （1）对实验室前期保存的一株产木聚糖酶真菌TL01 进行形态学、18S rDNA 及产 酶鉴定，其结果表明TL01 为梳棉状嗜热真菌，测得粗酶活为0.2500.03 U/mL；对其 两种主要的木聚糖酶基因（xyn11A 和 xyl43 ）进行克隆和分子生物学分析。xyn11A 预 测蛋白分子量24.36 kDa ，等电点为4.77 ，含有19 个氨基酸的信号肽序列，属于亲水性 蛋白，无跨膜结构域，其二级结构主要是无规则卷曲（44.89% ）；xyl43 蛋白分子量38.24 kDa ，等电点为 5.23 ，编码的胞内蛋白属于亲水性蛋白，无跨膜结构域，无规则卷曲 （59.76% ）是其主要的二级结构。 （2 ）通过紫外诱变技术并结合表型、测序验证得到一株 pyrG 营养缺陷型菌株 RIB40△pyrG 。将pyrG 筛选标记、启动子及信号肽amyB 、终止子amyBt 、组氨酸标签 及报告基因GFP 连入质粒pBC-Hygro 中，构建表达载体pBC-Hygro.4 。将载体通过PEG 法转入米曲霉RIB40△pyrG ，使用荧光显微镜观察可看到发出荧光的菌丝体，证明载体 构建成功。 （3 ）构建木聚糖酶-米曲霉表达载体pBC-Hygro-xyn11A 和pBC-Hygro-xyl43 并转 入米曲霉RIB40△pyrG 。通过菌落PCR 鉴定成功筛选到两种木聚糖酶-米曲霉表达宿主 菌。这也是首次构建木聚糖酶-米曲霉表达系统，为后续进一步进行木聚糖酶高效表达 研究奠定基础。 关键词：木聚糖酶、鉴定、pyrG 缺陷株、米曲霉表达载体、构建 iii Abstract Xylanase is a kind of xylan degrading enzyme system, widely used in food and feed fields. However, the application of the enzyme is currently restricted by factors such as low enzyme activity, poor thermal stability, and insecurity. In this paper, we combined the food-grade Aspergillus oryzae system and the xylanase-producing thermophilic strain to obtain xylanase-Aspergillus oryzae strain, which provides a new idea for using the genetic engineering technique researching xylanase with high enzyme activity and low cost. The main experimental results are as follows: (1) Using morphology, 18S rDNA and enzyme properties to identify the xylanase producing fungi TL01 which is saved by laboratory, the results show that the fungi is Thermomyces lanuginosus, the crude enzyme activity is 0.2500.03 U/mL; Cloning and ana