ABC家族成员OsABCG3参与调控水稻花粉壁的形成.pdf

摘要 水稻杂种优势利用是提升水稻产量的有效途径，而水稻雄性不育则是杂交水稻推 广和应用的基础，因此，对于水稻雄性不育的研究显得十分重要。近年来的研究表明， 花粉育性与花粉壁的发育密切相关，正常发育的花粉壁能够有效的保护雄性配子体， 并有助于花粉萌发。然而，目前对水稻花粉壁发育机制的研究相对拟南芥仍然滞后， 为深入了解水稻花粉壁发育机制，本研究通过对籼稻9311 的EMS 诱变库进行筛选， 发现了一个新的雄性不育突变体，成功克隆了该雄性育性控制基因，并验证功能。主 要研究结果如下： 1．突变体表型鉴定。通过对籼稻9311 的EMS 诱变库进行筛选，获得一个新的 雄性不育突变体，该突变体表现出正常的营养生长及花器官形态，但花粉粒显著减少、 干瘪萎缩、碘染不着色。因此，我们将该突变体命名为lsp1 （Less and shrunken pollen 1）。半薄切片结果显示lsp1 在花药发育第 11 期时绒毡层异常肿胀；在第 12 期形成 无内含物的花粉。电镜观察发现其花粉外壁的柱状体发育异常，花粉内壁缺失。 2 ．基因定位克隆。利用基因组重测序结合MutMap 技术分析发现一个特定SNP 连锁位点 （G A ），位于基因LOC_Os 01g 61940 唯一的外显子上，导致编码的蛋白第 587 个氨基酸改变 （Ser Asn ）。结合lsp1 的F2 代群体共分离验证，初步确定候选基 因为LOC_Os01g61940 。 3 ．候选基因验证。我们利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对LOC_Os01g61940 进 行编辑，得到的5 个纯合缺失突变体 （KO ）植株 （日本晴Nipp 背景），表型与lsp1 基本一致。结合KO 植株F2 代群体共分离验证，确定LOC_Os01g61940 就是控制该 雄性不育性状的基因LSP1 。 4 ．蛋白结构分析。LOC_Os01g61940 编码一个ABCG 家族转运蛋白OsABCG3 ， 在单双子叶植物之间是高度保守的，这表明OsABCG3 的生物学功能可能与其在拟南 芥中的同源基因AtABCG1 、AtABCG16 相似。3D 蛋白建模分析结果显示，在lsp1 突 变体中，LSP1/OsABCG3 基因的突变导致其编码蛋白结构中的一个β 折叠和两个α 螺 旋发生改变。 5 ．组织表达模式。qPCR 和GUS 实验结果显示，LSP1/OsABCG3 在第9 期花药 的体细胞层和小孢子中表达量最高，其次是在第 11 期的小孢子中特异表达。这表明 i LSP1/OsABCG3 参与到花药及花粉发育过程。 6 ．亚细胞定位。通过水稻原生质体瞬时表达实验，发现LSP1/OsABCG3 蛋白定 位于细胞质膜上，表明其可能在细胞质膜上行使功能。 综上所述，我们克隆了一个新的雄性不育控制基因LSP1 ，其编码一个ABCG 家 族转运蛋白OsABCG3 ，在水稻花粉壁发育过程中发挥重要作用。 关键词：水稻，雄性不育，花粉壁，ABCG 转运蛋白，OsABCG3 ii Abstract Utilization of hybrid rice heterosis is an effective way to increase rice yield, and the male sterility is the basis of the extension and application of hybrid rice. Therefore, it is very important to study rice male sterility. Studies in recent years have shown that pollen fertility is closely related to the development of pollen walls. Normally developed pollen walls can protect male gametophytes effectively and contribute to pollen germination.