RHDV抗体检测胶体金与量子点标记试纸条的试制.pdf

中文摘要 兔病毒性出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus ，RHDV ）主要引起兔 的一种急性、烈性、高度传染性和高度死亡性的疾病，由于感染该病毒后会导致 患兔多器官的出血充血，而将该病称为兔病毒性出血症 （rabbit hemorrhagic disease，RHD ）。本试验对RHDV VP60 截段基因进行原核表达，基于重组蛋白 对胶体金及量子点免疫层析试纸条进行初步探索研究。 1. RHDV VP60 截段基因的原核表达 根据 GenBank RHDV 基因序列，通过 RT-PCR 扩增 VP60 基因 （901bp-1740bp），连接至pMD19-T 克隆载体，经测序鉴定后，酶切、连接构建 重组表达质粒pCold TF-VP60-2 ，转化到大肠杆菌BL21 （DE3 ），经PCR、酶切 以及测序鉴定后的阳性菌扩大培养，用IPTG （1 mmol/L ）进行诱导表达，进行 SDS分析、Western-blotting 鉴定以及亲和层析法纯化蛋白ELISA 检测。 结果显示重组质粒构建成功，表达的重组蛋白为82.8 kDa ，并优化确定了37 ℃、 0.2 mmol/L、诱导6 h 为最佳诱导表达条件，经亲和层析法可获得5.16mg/mL 纯 化重组蛋白，包被重组蛋白的间接 ELISA 结果表明表达的重组蛋白能与兔抗 RHDV 抗体特异性结合，具有良好的反应原性。 2. RHDV 抗体检测胶体金免疫层析试纸条的试制 制备兔抗重组蛋白抗体，胶体金标记重组蛋白点样金标垫，兔抗重组蛋白多 克隆抗体标记C 线，羊抗兔IgG 标记T 线，设计RHDV 抗体检测试纸条，通过 T 线和C 线抗体用量的优化，特异性和敏感性试验，初步试制了RHDV 抗体检 测的免疫胶体金试纸条，对5 份试验免疫血清样品、5 份未免疫抗体阴性血清以 及临床采样154 份免疫过的血清进行试验。结果显示研制的胶体金试纸条具有良 好的灵敏性和特异性，其免疫血清灵敏度可达到1：16，特异性检测在兔抗RHDV 血清时T 线出现了红色条带，兔产气荚膜梭菌A 型血清及兔巴氏杆菌等血清在T 线未见显色条带，5 份阳性样品全部为阳性，5 份未免疫血清均为阴性，用设计 的RHDV 抗体试纸条检测临床采样的 154 份样品，结果显示 150 份为阳性，4 份为阴性，为RHDV 抗体水平监测提供一种可用的免疫试纸条。 3. RHDV 抗体检测的量子点免疫层析试纸条的试制 量子点标记重组蛋白为金标垫，兔抗重组蛋白多克隆抗体标记 C 线，羊抗 I 兔IgG 标记T 线，设计RHDV 抗体检测试纸条，通过T 线和C 线抗体用量的优 化，特异性和敏感性试验及样品检测应用，初步试制了可用于 RHDV 抗体检测 的量子点免疫层析试纸条。结果显示试制的量子点免疫层析试纸条具有良好的灵 敏性和特异性，其免疫血清灵敏度可达到1：32，特异性检测在兔抗RHDV 血清 时T 线出现了荧光条带，阴性血清及兔巴氏杆菌等血清在T 线未见显色条带， 5 份阳性样品全部为阳性，5 份未免疫血清均为阴性，用设计的RHDV 抗体量子点 试纸条检测临床采样的154 份样品，结果显示 150 份为阳性，4 份为阴性，与胶 体金免疫层析试纸条检测结果相符合，同时为量子点免疫层析试纸条进一步研制 奠定了基础。 关键词：RHDV ；VP60 ；抗体；胶体金；量子点； II Abstract Rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) infection mainly causes an acute, severe, highly contagious and highly dead disease in rabbits. The virus may cause bleeding and congestion of multiple organs in rabbits is call