1型鸭肝炎病毒诱导鸭胚成纤维细胞自噬的研究.pdfVIP

中文摘要 1 型鸭肝炎病毒（DHAV-1 ）属于小RNA 病毒科禽肝病毒属，可引起感染雏鸭高 度致死、传播迅速的急性传染病。细胞自噬是一种重要的清除病原体的细胞内途径。 DHAV-1 能否激活感染的宿主细胞发生自噬的研究鲜见报道。本研究以DHAV-1 感染 鸭胚成纤维细胞（DEF ）为模型，研究DHAV-1 诱导细胞自噬以及细胞自噬对病毒复 制的影响，获得结果如下： 1 DHAV-1 感染对DEF 细胞自噬的影响 DHAV-1 感染DEF 细胞后，蛋白质免疫印迹（Western blotting ）法检测到自噬标 志蛋白LC3 由LC3-I 酯化为LC3-II，透射电镜观察到细胞质内出现单层或双层膜结 构的自噬体囊泡，显微镜观察到转染荧光标记的 LC3 融合蛋白点状聚集形成明亮的 斑点，荧光定量PCR 检测到自噬相关基因5 的转录水平上调。确定DHAV-1 感染能 够诱导DEF 细胞自噬。 进一步检测感染细胞自噬底物蛋白 SQSTM1/p62 的转录与表达水平，结果表明 DHAV-1 感染可抑制细胞内SQSTM1/p62 的转录以及表达。pmCherry-GFP-LC3 双荧 光系统标记自噬体，显微镜观察GFP 荧光蛋白淬灭，pmCherry 荧光蛋白表达无影响， 融合蛋白表达呈黄偏红色。Lyso-Tracker Red 标记的溶酶体和GFP-LC3 标记的溶酶体 发生共定位。确定DHAV-1 感染促进自噬底物蛋白蛋白降解，及自噬体与溶酶体发生 融合，表明DHAV-1 感染DEF 细胞能够诱导发生完整的自噬过程。 2 DHAV-1 病毒蛋白完整性对细胞自噬的影响 分别用热灭活和紫外灭活的DHAV-1 处理DEF 细胞，Western blotting 检测LC3 的表达情况，发现在热灭活DHAV-1 添加的细胞中，LC3 表达没有变化，表明DHAV-1 诱导的自噬是由具有活性的病毒蛋白诱导产生的；而在紫外灭活的DHAV-1 添加的细 胞中，LC3 由LC3-I 酯化为LC3-II，表明紫外灭活法不能破坏DHAV-1 蛋白诱导自噬 的能力。 真核表达DHAV-1 所有基因。分别转染DHAV-1 VP0 、VP1 、VP3 、2A 、2B、2C 、 3A、3B、3C 和3D 基因的真核表达质粒，Western blotting 检测LC3 的表达情况，发 现2C 和3D 蛋白的表达不影响LC3 的表达情况，而DHAV-1 其他病毒蛋白的表达均 LC 能诱导 3 由LC3-I 酯化为LC3-II 。表明DHAV-1 病毒P1 区VP0 、VP1 、VP3 ，P2 区2A 、2B ，P3 区3A、3B 和3C 蛋白可诱导细胞自噬，紫外灭活DHAV-1 依然能够 诱导细胞自噬的原因可能是细胞自噬依赖DHAV-1 病毒蛋白完整性。 3 自噬对DHAV-1 增殖及胞外释放的影响 I 分别用自噬激动剂雷帕霉素和自噬抑制剂氟喹预处理DEF 细胞后，再感染等量 的DHAV-1，荧光定量 PCR 检测细胞内外的病毒拷贝数。结果表明雷帕霉素处理上 调细胞内外病毒拷贝数含量，氟喹处理下调细胞内外病毒拷贝数含量。比对各组别中 细胞内外病毒拷贝数的差值，发现雷帕霉素处理组中细胞内外病毒拷贝数差值最小， 而氟喹处理组中的细胞内外病毒拷贝数差值最大。表明激活自噬可促进DHAV-1 复制 及胞外释放。 进一步检测自噬抑制对DHAV-1 增殖的影响。自噬抑制剂氟喹预处理DEF 细胞 后，再感染 DHAV-1，TCID50 检测细胞内病毒含量。观察发现药物氟喹抑制自噬时， 细胞内DHAV-1 病毒含量下降，并且病毒含量下降的趋势与病毒感染时间相关。表明 抑制自噬能够阻碍DHAV-1 增殖。 综上，DHAV-1 感染DEF 细胞诱导产生完整的自噬及自噬流过程；DEF 细胞自 噬依赖DHAV-1 病毒蛋白完整性；细胞自噬可促进DHAV-1 增殖及胞外释放。 关键词 1 型鸭肝炎病毒，DEF ，自噬，病毒蛋白，病毒增殖 II ABSTRACT Duck hepatitis A vir