Marc-145细胞的低血清驯化及感染猪繁殖与呼吸综合征病毒后细胞自噬特性评价.pdfVIP

摘 要 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS ）为高致死性传染病，自2006 年在我国爆发至今， 已持续对我国养猪业造成巨大成经济冲击。作为提倡强制疫苗免疫的国家，我国每年 对 PRRS 疫苗的需求量十分巨大。为优化 PRRS 疫苗的生产工艺，降低生产成本，本 研究对 Marc-145 细胞的低血清培养工艺进行了探索，对在低血清培养环境下猪繁殖 与呼吸综合征病毒（RPRSV ）增殖情况、感染PRRSV 后细胞自噬进行探究。 采用逐步降血清法对 Marc-145 细胞进行低血清培养的驯化，以血清添加量为变 量，设置浓度：10%、8%、6%、4% 、2% 、1%、0%，对Marc-145 细胞进行低血清 培养驯化。经过连续 18 次传代，发现 Marc-145 细胞能适应的最低血清添加量为 1%。 通过测定细胞活率、计算细胞倍增比，发现 1%血清添加量下的 Marc-145 细胞状态良 好，至此成功得到了能稳定传代的血清添加量为 1%的Marc-145 细胞。为探究低血清 条件下 Marc-145 细胞内 PRRSV 增殖质量，进行了 PRRSV 接种，通过实时荧光定量 PCR 方法对病毒增殖进行测定，绘制病毒生长曲线；测定 PRRSV 的TCID50 ，查看低 血清培养下病毒毒力情况。利用电子显微镜对感染 PRRSV 后 Marc-145 细胞内自噬小 体进行观察，对不同培养环境下细胞自噬情况进行初步判断；而后通过荧光定量 PCR 方法对关键的自噬相关基因 Beclin1 、ATG5 、ATG12 转录量进行测定，进一步探究细 胞自噬水平情况。结果发现，感染 PRRSV 后，低血清培养下的 Marc-145 细胞维持时 间更长，病毒含量更高，增殖峰较常规血清培养下提前约 12h，但病毒滴度变化不明 显。在感染 PRRSV 后的 36h 时，不同培养条件下的 Marc-145 细胞内均观察到明显的 自噬小体，说明在感染PRRSV 后细胞均发生了自噬。在对 Beclin1 、ATG5 、ATG12 自噬基因的转录水平测定时发现低血清培养的Marc-145 细胞较常规血清培养而言自 噬相关基因的转录量均升高，提示低血清环境下 PRRSV 感染后细胞自噬加强，但这 种自噬进程并不影响病毒增殖，反而对复制有利。本研究对 Marc-145 细胞的培养条 件进行了探究，实现了细胞的低血清培养，阐明了低血清环境下 PRRSV 的培养特性 及细胞自噬情况，为 PRRSV 疫苗的生产和研发、PRRSV 与细胞自噬相关研究提供参 考与思路。 关键词：Marc-145 ；低血清培养；PRRSV ；自噬 I Abstract Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome is a highly lethal infectious disease. Since its outbreak in China in 2006, it has continued to cause huge economic impact on Chinas pig industry. As a country that promotes mandatory vaccine immunization, the demand for PRRS vaccine in China is very large. In order to optimize the production process of PRRS vaccine and reduce the production cost, our study explored the low serum culture process of Marc-145 cells , and explored the replication of RPRSV and autophagy after infected with PRRSV under low serum conditions. Acclimation of Marc-145 cells with low serum culture by stepwise serum reduction,