传染性胸膜肺炎放线杆菌（7型）AdhE蛋白的原核表达及其免疫保护性研究.pdfVIP

摘 要 胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae ，App ）是引起猪胸膜肺炎 的病原体，胸膜肺炎是一种具有高度传染性的严重猪疾病，对全球各地的养殖业均造 成了巨大的经济损失。猪胸膜肺炎以急性出血及慢性纤维素性胸膜肺炎为特征，可通 过接触传染。 AdhE 是一种双功能酶，具有乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶的催化活性。近年来，大 量研究结果表明 AdhE 在细菌感染宿主的过程中也发挥着重要调控作用。本试验以 App 7 型菌株感染小鼠肺组织后通过互作转录组分析获得的差异表达基因为前提，选 取上调基因中差异表达倍数最高的基因AdhE 作为研究对象。对该基因所编码的AdhE 蛋白进行了基因克隆和原核表达，对该重组蛋白的免疫原性及其对小鼠的免疫保护作 用进行了探究。 1. App7 型AdhE 蛋白的原核表达及其免疫原性分析 通过扩增App7 型菌株的AdhE 全基因，对其所编码的蛋白进行生物信息学分析， 发现该蛋白高度保守。为了分析AdhE 蛋白的免疫原性，本试验成功构建pET-32a(+)- AdhE 大肠杆菌表达载体，于大肠杆菌BL21 中表达，成功表达大小约为110kDa 的蛋 白。以纯化的rAdhE 蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体，结果显示在加强免疫后的小鼠 血清中能检测到较高的IgG 抗体水平，抗体滴度的对数值能达到lg=4.609，Western blot 特异性检测结果显示，多克隆抗体中含有高水平抗rAdhE 特异性抗体，进一步证明 AdhE 具有很强的免疫原性。 2. App7 型AdhE 蛋白的免疫保护性分析 本试验通过小鼠的攻毒保护性试验、肺组织病理切片分析以及监测以非致死剂量 App 感染小鼠前和感染后4 、8、12、24 、48h 小鼠的细胞因子表达水平，对App 的 AdhE 蛋白能否对App 感染小鼠提供有效的免疫保护力进行评估。以致死剂量App7 型或App1 型菌株腹腔注射攻毒试验小鼠，结果显示PBS 组小鼠均在36h 内全部死亡， rAdhE 组小鼠分别能获得获得90% （App7 ）或70% （App1 ）的保护力，保护力均略 低于疫苗组的100%。组织病理学观察结果显示，相较于PBS 组小鼠肺组织严重病变 呈间质性肺炎且组织中有大量炎性细胞浸润，rAdhE 组小鼠的肺组织病变较为轻微， 仅肺泡壁以及支气管周围可见少量以中性粒细胞为主的炎性浸润，但是rAdhE 组小 鼠肺组织中的炎性细胞数量仍然略高于疫苗组免疫的小鼠肺组织。细胞因子监测结果 I 发现，rAdhE 组小鼠在感染App 前即可诱导机体产生IFN-γ ，激活宿主的天然免疫； 在感染App 初期4h 内，PBS 组和rAdhE 组三种细胞因子相较感染前均呈现出显著高 表达现象，小鼠为应对急性炎症而刺激机体产生大量炎性细胞因子；随着感染病程的 发展，可明显观察到相较于PBS 组小鼠，rAdhE 组的小鼠IL-6、TNF-α 和IFN-γ 的表 达显著受到了抑制，使得小鼠在感染 12h 内便将炎症反应控制在较低的水平，表明 AdhE 具有良好的免疫调节作用，通过调控小鼠体内IL-6、TNF-α 和IFN-γ 细胞因子 的含量有效控制了细菌感染后的炎症反应。本研究证明了高度保守的AdhE 蛋白具有 良好的免疫原性以及免疫调节作用，具有抗App 1 和App7 感染的交叉免疫保护作用。 关键词：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌；双功能乙醛/ 乙醇脱氢酶；免疫原性；免疫保 护性 II ABSTRACT Actinobacillus pleuropneumoniae (App) is the causative agent of porcine pleuropneumonia. Pleuropneumonia is a highly contagious severe pig disease that has caused huge economic losses to the