林麝源肺炎克雷伯氏菌GPKP基因kp05372缺失株的构建及其生物学特性分析.pdfVIP

摘要 肺炎克雷伯氏菌是重要的条件致病菌，可导致林麝肺炎，从而引起死亡。肺炎克雷 伯氏菌中的LysR 型转录调控因子可参与调控其毒力、分解代谢、耐药性等。本研究通 过构建林麝源肺炎克雷伯氏菌GPKP 中新发现的LysR 型转录调控基因的缺失株及回补 株，比较三者的生长曲线、药敏试验、生物被膜、抗逆性、细菌半数致死量、定殖能力 及其引起的器官病理形态学等生物学特性的差异，探究该转录调控因子的基本功能，主 要试验结果如下： 1. 林麝源肺炎克雷伯氏菌基因kp05372 缺失株及回补株的构建：扩增基因kp05372 上下游同源臂，交叠PCR 获得融合片段，以pLP12T 质粒为载体，通过无缝克隆连接， 成功构建重组自杀质粒。通过接合转移，在氯霉素压力正向筛选及阿拉伯糖诱导反向筛 选下，经两次同源重组，最终成功筛选到缺失株 GPKP-△kp05372 。以质粒pBAD33 为 载体克隆连接敲除基因片段kp05372，成功构建回补表达质粒pBAD33-KP 。通过接合转 移，阿拉伯糖诱导调节基因表达量，成功筛选到回补株GPKP-△kp05372+ 。 2. 林麝源肺炎克雷伯氏菌生物学特性分析：三株菌生长速率无显著差异，均表现为 2 h 后迅速增长，12 h 达到最大，持续至 18 h 后，活菌量逐渐下降；野生株及回补株生 物被膜形成能力强于缺失株；缺失株对头孢噻吩、复方新诺明及多粘菌素B 产生了耐药 性，对庆大霉素、氧氟沙星等的抑菌圈直径缩小5 mm 以上，对新霉素的抑菌圈直径则 增大5 mm 以上；三株菌在不同的渗透压、温度、盐含量及过氧化氢浓度下无显著变化。 在pH 2-7 范围内，随pH 值升高，缺失株耐酸能力逐渐下降；野生株、缺失株及回补 7 10 9 株对小鼠的半数致死量分别为6.3×10 CFU/mL、1.1×10 CFU/mL、4.88×10 CFU/mL； 肝脏中三株菌的含量下降后保持稳定定殖，心脏、脾脏、肾脏及肠道中缺失株含量最先 下降为0 ，定殖能力最弱；三株菌均能引起肝、肺的严重组织病理变化。 综上所述，本研究成功构建 GPKP 基因缺失株 GPKP-△kp05372 及回补株 GPKP-△kp05372+ 。比较生物学特性差异发现该基因缺失导致GPKP 生物被膜形成能力 下降，耐药性发生变化，毒力下降，还可能参与调控GPKP 的抗酸性机制。为进一步研 究LysR 型转录调控因子GPKP 基因kp05372 的调控机制做铺垫。 关键词：林麝；肺炎克雷伯氏菌；LysR 转录因子；基因kp05372 ；生物学特性 I Abstract Klebsiella Pneumoniae is an important opportunistic pathogen that can cause pneumonia and even death in musk deer. LysR transcriptional regulators in Klebsiella Pneumoniae are involved in the regulation of virulence, catabolism and drug resistance. The present study was aim to construct the deletion and replenishment of LysR transcriptional regulatory genes newly found in Klebsiella Pneumoniae GPKP from forest musk deer, and compare the biological characteristics differences among the three strains, including growth curve, drug sensitive test, biofilm, the r