生物制药工程原理与设备 电子教材 单元九 色谱分离.docVIP

单元九 色谱分离 色谱分离技术起源于20世纪初，1950年后得到飞速发展，形成了一个独立的三级学科-色谱学。目前，色谱分离法已广泛应用于各类制药生产活动中。 项目一 色谱离基本知识 色谱法是利用混合物中各组分在固定相和流动相中分布不同进行分离的过程，按流动相可分为气相色谱和液相色谱；按固定相又可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱；按流动相速度可分为低压色谱和高效液相色谱。色谱分离设备有动态釜式色谱柱和静态管式色谱柱两大类。 一、色谱分离法 图9-1 色谱分离过程1.色谱分离原理 各种物质都有特定的物理化学性质，如分子极性、分子之间的作用力、分子形状、分子直径大小等。根据相似相溶原理，如固定相物理化学性质与组分性质相当或者相近，则该组分在固定相中的分配比例大，在流动相中分配比例小，反之则疏远固定相而分配到流动相中。当流动相流过固定相时，在固定相中分配比例大的组分整体移动速度慢，在流动相中分配比例大的组分将随流动相快速流出，经过一定时间后，各组分在固定相上移动了不同的距离，从而分离开来。这种利用各组分物理化学性质的差异，使各组分在固定相和流动相中的分布程度有差别，导致各组分移动速度不同而被分离的过程，称为色谱分离法，又叫层析分离法。如图9-1所示。 图9-1 色谱分离过程 2.色谱分离固定相 色谱分离的固定相有多种，如活性炭、硅胶、三氧化二铝、离子交换树脂、大孔树脂、羧甲基纤维素、凝胶等，同种固定相又有多种型号。根据物理化学性质又将固定相分为非极性固定相和极性固定相两大类。 二、色谱分离法分类 根据固定相的构成，流动相的状态以及分配原理，可分为多种色谱分离法。 1.气相色谱和液相色谱 色谱分离中的流动相分为气相和液相。气相多数情况下采用氮气作载体，样品通过高温汽化成复杂混合气体后进入氮气流动，这种分离法叫气相色谱。流动相是液体的叫液相色谱。液相色谱的流动相分为水相和有机相两大类。水相即是水溶液作流动相，有机相则是用有机溶剂作流动相。在生物药物分离纯化过程中，主要采用液相色谱分离法。 2．按作用原理划分 （1）吸附色谱：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。如硅胶色谱、三氧化二铝色谱、活性炭色谱等。 （2）分配色谱：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离的方法。如三氧化二铝分配色谱等。 （3）离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同的分离方法。如阳离子交换树脂法、阴离子交换树脂法等。 （4）凝胶色谱：利用不同组分分子大小的不同进行分离的方法。 （5）亲和色谱：利用生物分子之间特异的亲和力进行分离的方法。 色谱分离法是纯化生物药物的主要方法，通过色谱分离可将生物药物精制到要求的纯度。 3.按流动相流速划分 （1）低压色谱：采用低压输送泵输送流动相，流动相压力小于0.3MPa,在色谱柱中流速缓慢。因流动阻力大，低压色谱分离过程耗时长，目前主要用于部分常规药品的分离纯化。 （2）高效液相色谱：采用柱塞式往复泵输送流动相，流动相压力高达15MPa至30MPa左右，在高压下流动相快速通过固定相，进样后数分钟即可得到分离后的目标产物洗脱液，这种分离法叫高效液相色谱法。用于分离纯化生物药品的制备型高效液相色谱，用于分析检验药物理化指标的叫分析型高效液相色谱。制备型高效液相色谱进样量大，分析性高效液相色谱进样量小。 三、色谱柱的结构 进行色谱分离的设备叫色谱柱，各种色谱分离法所采用的色谱柱结构上大同小异，所以现以分配色谱柱为代表介绍有关结构和操作过程。 1.色谱柱材料 制造色谱柱的材料可以是玻璃、有机玻璃、金属和高分子塑料。其中，金属材料可分为碳钢和奥氏不锈钢，用作离子交换柱时需在内壁上用橡胶衬里；塑料材料可分为聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯等。 2.色谱柱的尺寸特性 通常将色谱柱制成管式和罐式两种，管式色谱柱分离过程叫静态分离法，罐式色谱柱因有搅拌器转动而称为动态色谱分离法。 管式色谱柱的尺寸对分离效果有较大的影响，影响大的指标是色谱柱的高度与其内径的比值，称为高径比，一般要求是L/D=10～30，如果高径比大，则分离效果更好，但过长的色谱柱会产生较大的流动阻力，且带来“壁面效应”，导致色带不清晰，容易产生返混。在进行分离时要根据具体组成确定高径比。 3.典型结构 常见的色谱柱有玻璃色谱柱、夹套色谱柱、反转式色谱柱等，如图7-16所示。大型色谱柱的关键零部件是液体分布器，料液经分布器均匀地分散后飘洒到色谱柱中，以免扰乱固定相上方液体的层流状态。 图9-2常见色谱柱的结构 （1）玻璃色谱柱：玻璃色谱柱用得非常广泛，如图9-2所示。玻璃色谱柱的优点是直观，可以观察柱内情况。另一个优点是玻璃材料化学性质稳定，一般不发生化学反应，能抵抗酸碱氧化腐蚀，因此不会污染组分，所以玻