发酵工程技术 自然选育 2.2.1自然选育.pptVIP

2. 工业发酵菌种的选育 2.2.1 自然选育 自然选育的概念 在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变面进行菌种筛选的过程，称为自然选育或自然分离。 自然选育的步骤 1.采样 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。 纤维素酶产生菌选择枯枝落叶富含纤维素的森林土； 淀粉酶产生菌选择面粉厂、酒厂、糕点厂等场所的土壤； 蛋白酶和脂肪酶产生菌可选择肉类加工厂附近污泥等。 自然选育的步骤 从自然界筛选 自然选育的步骤 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 自然选育的步骤 2.富集培养 富集培养可增加待分离菌的数量，增加分离的成功率。 为了容易分离到所需的菌种，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖、淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。 自然选育的步骤 为提高分离的效率, 常以投其所好和取其所抗的原则在培养基中添加特殊的养分或抗菌物质, 使所需菌种的数量相对增加, 这种方法称为增殖培养或富集培养, 其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌, 便于将它们从样品中分离。 例如分离放线菌时，在土壤样品悬液中加入数滴10％的酚，可抑制霉菌和细菌的生长。 自然选育的步骤 富集的主要方案： 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。控制营养和培养条件增加目的微生物数量，也可高温高压、加入抗生素等减少非目的微生物的数量。 目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 自然选育的步骤 定向培养的富集方法 1.底物 2.pH条件 3.培养时间 4.培养温度 等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批、连续）后使目的微生物在种群中占优势。 自然选育的步骤 菌落的选出 从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。 自然选育的步骤 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 采样（造纸 厂） →80℃、30min处理 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5、 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落 从285个土样中获得62株 26株为组成型 36株为诱导型 ↓ 自然选育的步骤 3.培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化，在固体培养基平板上获得单菌落。 纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。 自然选育的步骤 分离的效率取决于培养基养分、pH、温度和加入的选择性抑制剂。 嗜中性放线菌分离培养基pH常在6.7~7.5，嗜酸性放线菌pH降至4.5~5.0。 放线菌筛选时，可加入真菌抗生素，对放线菌无作用。 分离放线菌分离平板通常在25~30℃培养。嗜热菌45~55 ℃ ，嗜冷菌4~10 ℃ 。