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加压筛选试剂 MTX 加压方法简介 诞生于 70 年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点， 己迅速成为制药工业中一个引人注目的领域。 1995 年美国基因工程药物销售额约为 48 亿美元， 1997 年超过 60 亿美元，年增长率达 20% 以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。 基因工程药物研发的主要环节包括： 基因克隆和工程菌构造；重组细胞培养；目的产物分离纯化等。 针对以上主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。 目前已有多种表达系统应用于表达具有医疗价值的蛋 白质，如大肠杆菌、酵母、昆虫杆状病毒系统、哺乳动物细胞等表达系统。 大多数药用蛋白都是糖蛋白，中国仓鼠卵巢细胞（ CHO ）是目前重组糖基蛋白生产的首选体系 ，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达， 部分药物已投放市场，例如 EPO、G-CSF、组织型纤溶酶原激活剂 t-PA 、CD 受体、单克隆抗体、乙型肝炎表面抗原、白介素、干扰素 等。 影响重组蛋白在 CHO 细胞中表达的因素很多，层次也很广泛，涉及 CHO 细胞表达体系、 表达载体系统、 外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等。 转录是真核基因表达调节的基本控制点， 研究表明：所有提高转录水平的策略主要通过载体构建、 基因转染方法和选择不同标记来调控； CHO 细胞表达体系和外源基因影响 mRNA 的翻译； 表达细胞株的加压扩增，目的在于扩增外源基因的拷贝数， 从而提高表达量 ；筛选表达细胞株，可获得稳定的、高表达的单克隆细胞株； 大规模细胞培养中， 血清、溶氧、二氧化碳、氨、乳酸的浓度以及剪切力影响细胞的生长、 外源蛋白的表达和纯化。 深入了解和灵活运用各种影响因素， 有助于重组蛋白在 CHO 细胞中的高效表达。 （一） CHO 表达系统 CHO 细胞表达体系 常用的 CHO 细胞系有两种： CHO 和 CHO-dhfr -。CHO 表达系统 是目前应用最广泛的真核表达系统之一， 与其它表达系统相比， 它具有许多优点： 准确的转录后修饰功能， 表达的糖基化药物蛋白在分子结构、 理化特性和生物学功能方面 最接近天然蛋白分子 ；表达产物胞外分泌，便于分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和 表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到 1000L 以上；CHO细胞属于成纤维细胞， 很少分泌内源蛋白， 利于外源蛋白的分离纯化。 改造 CHO 细胞，可更好地表达外源蛋白。 为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将 bcl-2 基因（细胞凋亡抑制基因） 导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制 Gln 或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗， 提高细胞密度和目的蛋白产量。向 CHO 细胞中导入p21、p27 基因，可使细胞 G1 期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常， 营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。 载体系统 借助真核基因表达调控的理论， 可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中， 使其方便高效地表达外源基因。 目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和 Poly A 信号等；CHO 细胞表达载体 中主要有两类选择标记： 非扩增基因和共扩增基因。 2.1 启动子和增强子 启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。作为表达载体元件之一， 启动子既需强的转录活性，又应具备较广的应用范围。 细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用， 所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因 组中分离得到。 SV40、LTR 和 CMV 启动子在 CHO 细胞中效果良好 。有研究表明：在 CHO 细胞中， CMV 启动子的转录活性分别是 SV40 启动子和 LTR 启动子的 10 倍和 30 倍左右。来 源于噬菌体的一些启动子，如 T7 启动子也可用 于动物细胞。 除了病毒来源的启动子， 现在热衷 于寻找细胞内源性的启动子， 如肽链延长因子基 因的启动子（EF-1 α）、鸡胞浆β肌动蛋白启动 子等。EF-1 α启动子是迄今应用中最强的启动子 之一 。目前商业化的表达载体中主要使用 SV40、 CMV 和 EF-1α启动子。 外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响，如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面， 其中尤以转录水平的 调节最为重要。在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现，由于在特定的细胞内，反式作用因子是固定的，不可改变的，因此基因的表达主要取决于其顺式作