双脱氧末端终止测序法原理 过程与目标基因cDNA序列拼接与分析.ppt

分子生物学实验 双脱氧末端终止法测序的原理、 过程和目标基因序列的分析 教师:程琳 2011年11月  实验目的 1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原 理,掌握DNA测序的基本方法; 2、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜 索和比对。  、DNA测序的方法 DNA测序技术主要有两种方法,都是在20世 纪70年代中期发明的。 A.双脱氧链终止法( the chain termination method),是通过合成与单链DNA互补的多核苷 酸链来读取待测DNA分子的顺序。 化学降解法( chemical degradation method) 是将双链DNA分子用化学试剂处理,产生切口, 用同位素标记进行测序。  dNTP A.C,G或T 基本原理 诚基 √聚丙烯酰胺凝胶电泳可以 HO-P-0-P-0-P-0-CH2/O 区分长度只差一个核苷酸的 DNA分子 √利用DNA聚合酶不能够区 分dNTP和 ddNTP的特性, ddNTP AC使 ddNtP参入到寡核苷酸链 的3-末端。因为 ddNTP3不 H0-P-0-P-0-P-0-CH2∠0 是OH,不能与下一个核苷 酸聚合延伸,从而终止DNA 链的增长  模板 TAGCAACT 引物 ATCGTTGA 荧光 标记 」引物延长和合成阳断 双 脱 dATP dATP dATP dATP+ddATP dGTP+ddGTP 氧 ddTTp dCTP+ddCTP dCTP 法 dTTP TTP dTTP 原 -ATCGTddT adds ATCGTTddG ATCGTTGddA 理 ATCGddT -ATCddG ddA AddT 示 意 长排列 图 ATCGTTGddA Tdd G AAA 自造接雷 AddT  2、具体操作: 测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外 分别加入23-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸(称 为 ddaTp,dCTP, ddgtp, ddTtp),然后进行聚 合反应。在第一个反应中, ddaTP会随机地代替 dATP参加反应,一旦dATP加入了新合成的 DNA链,由于其第3位的OH变成了H,所以不能 继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是 到A就终止了  同理第二个反应产生的都是以C结 尾的;第三个反应的都以G结尾,第四个 反应的都以T结尾,电泳后就可以读出序 列了  假如有一个DNA,互补序列是 GATCCGAT,我们试着做一下: 在第一个反应中由于含有dNTP+ ddatP,所以遇到G,T, C三个碱基时没什么问题,但遇到A时,掺入的可能是dATP或 ddAtP,比如已合成到G,下一个如果参与反应的是dATP则终 止,产生一个仅有2个核苷酸的序列:GA,否则继续延伸,可以 产生序列 GATCCG,又到了下一个A了.同样有两种情况,如果 是 ddatP掺入,则产生的序列是 GATCCGA,延伸终止,否则可 以继续延伸,产生 GATCCGAT 产生的都是以A结尾的片段:GA, GATCCGA 将得到如下结果: 产生的都是以C结尾的片段:GATC, ATCC 产生的都是以G结尾的片段:G, GATCCG 》产生的都是以T结尾的片段:GAT, GATCCGAT  制得的四组混合 CTAAGCTCGACT 物全部平行地点加在 dctp dGtP. datp dTTP 变性聚丙烯酸受凝胶 电泳板上进行电泳, TTCGAGCTGddA ATTCGAGddC m0每组制品中的各个组 TCDd 分将按其链长的不同 得到分离,从而制得 相应的放射性自显影 图谱。从所得图谱即 可直接读得DNA的碱 = 基序列。 凝胶放射自显彩图 即可得到测序结果:为 GATCCGAT