研究应用蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤.docVIP

研究蛋白质和蛋白质相互作用方法总结-试验步骤 蛋白质和蛋白质之间相互作用组成了细胞生化反应网络一个关键组成部分，蛋白-蛋白互作网络和转录调控网络对调控细胞及其信号相关键意义。把原来spaces空间上一篇蛋白质和蛋白质间相互作用研究方法转来，算是试验技巧分类目录首篇。(另补充2： \o 检测两种蛋白质之间相互作用试验方法比较 检测两种蛋白质之间相互作用试验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是目前广泛用于蛋白质相互作用组学研究一个关键方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因开启子，开启报道基因在酵母细胞内表示，假如检测到报道基因表示产物，则说明二者之间有相互作用，反之则二者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用研究。在实际工作中，大家依据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导双杂交系统。能够研究膜蛋白功效，丰富了酵母双杂交系统功效。另外，酵母双杂交系统作用也已扩展至对蛋白质判定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表示出对应单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目标蛋白，就会和对应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也关键用于研究蛋白质之间相互作用，不仅有高通量及简便特点，还含有直接得到基因、高选择性筛选复杂混合物、在筛选过程中经过合适改变条件能够直接评价相互结合特异性等优点。现在，用优化噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠两种特殊细胞系cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导路径中信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中新手段。它原理是利用一个纳米级薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白和诱饵蛋白结合后，薄膜共振性质会发生改变，经过检测便可知这两种蛋白结合情况。SPR技术优点是不需标识物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间距离及其相互作用; 和荧光显微镜结合，可定量获取相关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 时空信息。伴随绿色荧光蛋白（GFP）发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子动态性质。提出了一个定量测量FRET效率和供体和受体间距离简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体发射谱消除光谱间串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 效率和供体和受体间距离，尤其适适用于基于GFP 供体受体对。 五、抗体和蛋白质阵列技术 蛋白芯片技术出现给蛋白质组学研究带来新思绪。蛋白质组学研究中一个关键内容就是研究在不一样生理状态下蛋白水平量变，微型化，集成化，高通量化抗体芯片就是一个很好研究工具，她也是芯片中发展最快芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就各个领域里。 六、免疫共沉淀技术 免疫共沉淀关键是用来研究蛋白质和 蛋白质相互作用一个技术，其基础原理是，在细胞裂解液中加入抗爱好蛋白抗体，孵育后再加入和抗体特异结合结合于Pansobin珠上金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正和爱好蛋白结合目标蛋白，就能够形成这么一个复合物：“目标蛋白—爱好蛋白—抗爱好蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这么复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目标蛋白是什么，是否为估计蛋白。这种方法得到目标蛋白是在细胞内天然和爱好蛋白结合，符合体内实际情况，得到蛋白可信度高。但这种方法有两个缺点：一是两种蛋白质结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必需在试验前估计目标蛋白是什么，以选择最终检测抗体，所以，若估计不正确，试验就得不到结果，方法本身含有冒险性。 七、pull-down技术 蛋白质相互作用类型有牢靠型相互作用和临时型相互作用两种。牢靠型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好经过免疫共沉淀（Co-IP） 、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化、已标识饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从细胞裂解液中钓出和之相互作用蛋白。经过Pull-down技术能够确定已知蛋白和钓出蛋白或已纯化相关蛋白间相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。 检测两种蛋白质之间相互作用试验方法比较 研究蛋白