日本血吸虫跨膜蛋白SjTMEM66P功能的初步探索.pdfVIP

摘 要 血吸虫病是由血吸虫尾蚴感染引起的一种人畜共患寄生虫病，对宿主造成严重病理性损害， 是WHO 确定的六大重点热带病之一。由于血吸虫的多阶段发育生活史比较复杂，虫体诱发宿主 的免疫应答机制以及逃避机制不甚清晰，使获得良好保护效果的血吸虫病疫苗研究被制约。因此， 寻找更有效的疫苗候选分子也许成为防控血吸虫病的一种重要途径。 跨膜蛋白位于生物膜两端，贯穿细胞与外界之间，具有介导信号转导、分子运输、能量转换 等多种重要的功能。位于血吸虫体被的跨膜蛋白，直接与宿主的免疫系统相接触，因此，体被跨 膜蛋白可能为宿主与虫体信息交流的重要分子。开展跨膜蛋白的功能研究对日本血吸虫疫苗的开 发也很有必要。 本论文对跨膜蛋白TMEM66P 在血吸虫寄生和生殖发育中的功能进行初步探索，主要包括以 下三个方面的研究： （一）日本血吸虫TMEM66P 基因编码cDNA 的克隆表达及生物信息学分析 根据日本血吸虫 TMEM66P 序列设计引物，进行PCR 扩增出该序列的cDNA 片段，序列分 析表明扩增的该cDNA 片段包括1008 bp 的开放阅读框，编码蛋白预测分子量为37.93 kD 。生物 信息学分析表明TMEM66P 存在跨膜区，TMEM66P 序列与曼氏血吸虫同源性为67.79% ，与小鼠 同源性为44.54% 。另外，本研究中成功构建了原核重组蛋白pET32a(+)-TMEM66P，并成功表达 纯化。 （二）TMEM66P 在日本血吸虫不同发育时期和性别中的转录分析 通过RT-PCR 方法检测TMEM66P 在日本血吸虫的不同发育时期及性别中的转录水平。结果 显示TMEM66P 基因在日本血吸虫不同发育时期均有表达，在日本血吸虫虫卵及感染小鼠的35 d 虫体的表达量显著高于14 d、21 d ，在感染的28 d 虫体的表达量次之。此外，在感染小鼠的28 d 虫体中，TMEM66P 在雄虫中表达量高于雌虫，在感染的35 d 虫体中，TMEM66P 在雄虫中的表 达显著高于雌虫。上述结果表明TMEM66P 在不同发育时期及不同性别中具有表达差异性，提示 该基因可能在日本血吸虫的生殖产卵和生长发育中起重要作用。 （三）日本血吸虫TMEM66P 的功能初步研究 利用RNAi 技术对日本血吸虫TMEM66P 基因进行体外干扰实验，筛选出干扰效果最佳的小 RNA 分子（siRNA-664 ）。利用RT-PCR 对干扰后虫体卵壳蛋白基因进行检测，发现卵壳蛋白基因 AY222895.1 ，AY814244.1 ，M59318.1 和D32205.1 基因表达水平显著降低。利用CellTiter-Lumi™ 法检测干扰血吸虫后的虫体细胞活性，虫体细胞活力显著下降；对干扰后虫体产卵量进行统计分 析，发现干扰后虫体产卵量显著降低；随着干扰时间延长，虫体活力逐渐降低。表明 TMEM 66P 表达水平的下降对雌虫产卵及虫体活性均有影响，提示TMEM66P 可能在日本血吸虫生殖发育中 发挥重要调控作用。 关键词：日本血吸虫，TMEM66P，RNA 干扰，发育 I Abstracts Schistosomiasis is a zoonotic parasitic disease caused by infection of cercariae, which causes serious pathological damage to the host. Schistosomiasis is one of the six key tropical diseases identified by WHO. Due to the complexity of the multistage development and life cycle of schistosome, the mechanism of immune response and escape of the host induced by the parasite are not very clear, which restricts the research on schistosomiasis vaccine with good protective effect. Therefore, find