日本脑炎病毒基因Ⅰ型弱毒株鉴定.pdfVIP

摘要 日本脑炎（Japanese encephalitis ，JE ）是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus JEV ）感染 引起的人畜共患传染病。通过疫苗免疫接种，能够预防JE 。前期研究发现，JEV 优势基因型由基因 III 型转变为基因I 型，而基因III 型来源的疫苗不能够完全保护基因I 型JEV 感染，需要研发基因I 型疫苗。为此，开展了如下研究。 为了鉴定细胞传代致弱的基因 I 型弱毒株 SD12-F120，在体外和体内比较了 SD12-F120 株与亲 本强毒株 SD12 的表型和基因型差异。SD12-F120 在 BHK-21 细胞上形成了较小的病毒噬斑，且在 5 小鼠原代神经元细胞和小鼠脑中的复制能力降低。通过腹腔或脑内途径接种高达 10 PFU 的 SD12- F120 ，小鼠均未表现出JEV 感染的临床症状，表明SD12-F120 的神经侵袭力和神经毒力明显降低。 SD12-F120 免疫小鼠后，使用SD12 攻毒，免疫小鼠未出现临床症状，获得全面保护。 比较分析了SD12-F120 和 SD12 间核苷酸序列差异，共发现29 个核苷酸突变，其中 20 个属于 无义突变，9 个突变导致 8 个氨基酸变异，其中E 蛋白上2 个，NS1 蛋白上 1 个，NS3 蛋白上2 个， NS4B 蛋白上 1 个和NS5 蛋白上2 个。将 SD12-F120 和 SD12 间的氨基酸变异与其他四对弱毒株和 强毒亲本株间的氨基酸变异进行比较，发现变异氨基酸的数量和位置彼此不尽相同。在比较的五组 弱毒株和强毒亲本株中，E138 和 E176 变异分别存在于四组和三组中，而其他的氨基酸突变几乎是 各自所独有。这一结果表明，JEV 致弱过程中的遗传变异具有毒株特异性，显示了JEV 减毒/毒力相 关机制的复杂性。 由于 SD12-F120 是在 BHK-21 细胞上连续传代获得的，不符合疫苗生产要求。为此，SD12- F120 在Vero 细胞连续传代20 代，获得了Vero 细胞适应株 SD12-F120VC 。分析病毒滴度发现，随 着在 Vero 细胞上传代次数的增加，病毒滴度逐渐增高。SD12-F120VC 的病毒滴度显著高于 SD12- F120 ，表明SD12-F120VC 在Vero 细胞上具有良好的适应性。噬斑分析发现，SD12-F120VC 的噬斑 形态与SD12-F120 基本一致。用 SD12-F120VC 免疫小鼠，免疫小鼠能够抵抗基因I 型SD12 毒株的 攻击，但不能抵抗基因 III 型异源毒株N28 的攻击。此外，SD12-F120VC 免疫小鼠血清中，针对同 源 SD12-F120VC 和 SD12 的中和抗体效价高于异源 N28 毒株。与 SD12-F 120 比较发现，SD12- F120VC 的prM 蛋白存在 6 个氨基酸变异，其中 4 个位于pr 结构域，这可能与Vero 细胞适应有关。 综上所述，本研究比较分析了基因 I 型弱毒株和亲本强毒株间的表型和基因型特征差异，验证 了基因I 型弱毒株的保护效果，为基因I 型疫苗研发提供了数据。 关键词：日本脑炎病毒，弱毒株，氨基酸变异，疫苗，适应 I Abstract Japanese encephalitis (JE) is a vector-borne zoonotic viral disease caused by (Japanese encephalitis virus, JEV). Vaccination is the most effective way to control JE in both humans and pigs. However, JEV genotype shift that the dominant genotype III (GIII) has been replaced by genotype I (GI) raised concerns about