蜱唾液腺组织退化中的细胞自噬和细胞凋亡的联络机制研究.pdfVIP

摘 要 蜱是仅次于蚊子的第二大病原传播媒介。蜱的唾液腺在吸血过程中具有关键作用，也是蜱传 播病原的主要器官。蜱的唾液腺在饱血后会经历快速的退化，以适应后续蜕皮发育或生殖产卵的 生理学需要，但其调控机制不明。本论文以镰形扇头蜱为研究对象，聚焦蜱吸血后唾液腺退化这 一生物学现象，从唾液腺退化过程中细胞自噬和凋亡的联络机制上展开研究，以期在分子水平上 解析蜱的退化机制，为蜱的新型控制技术提供理论基础。主要研究结果如下： 一、蜱唾液腺退化过程中的细胞自噬和细胞凋亡的动态检测和转录组分析 通过透射电镜（TEM ）和TUNEL 染色结果显示在整个蜱的吸血期和饱血后均可观察到双层 膜包裹的自噬体，细胞自噬无显著变化；但进入快速吸血期和饱血后蜱的唾液腺TUNEL 染色阳 性率显著升高，表明蜱的唾液腺退化以细胞凋亡为主。根据上述结果，选择未吸血及饱血后唾液 腺进行转录组差异分析筛选关键基因，结果表明大部分细胞自噬相关基因的转录水平无显著变化， 而大部分细胞凋亡相关基因的转录水平饱血后显著上升，与饱血后蜱唾液腺细胞凋亡水平显著升 高基本一致。 二、蜱唾液腺退化中重要的细胞自噬和凋亡分子的基因克隆、序列分析和重组表达 根据不同吸血时间唾液腺转录组的分析结果，我们选择其中两个自噬相关（ATG ）分子和三 个细胞凋亡相关胱天蛋白酶（Caspase ）分子开展进一步研究，分别克隆其编码基因。根据序列比 对结果，两个ATG 分子命名为RhATG5 和RhATG6 。三个细胞凋亡相关 Caspase 分子，命名为 RhCaspases-7、-8、-9，均具有胱天蛋白酶的保守序列特征。经原核表达获得重组蛋白用于制备多 克隆抗体，后续研究奠定了基础。 三、RhCaspase-7、-8、-9 之间的相互作用及其在蜱唾液腺退化中的作用机制 RT-qPCR 分析证实，RhCaspase-7、-8、-9 的转录水平在每个发育阶段的饱血阶段（饱血幼蜱、 饱血若蜱和饱血成蜱）显著升高。饱血后唾液腺中RhCaspases-7、-8、-9 的转录水平比其他组织 增加也更加显著。RNA 干扰RhCaspase-9 可显著抑制蜱的吸血，而干扰RhCaspase-7、-8 后对蜱 的吸血并无影响；与对照组相比，干扰RhCaspase-7、-8 和-9 后，凋亡水平显著降低。共转染实 验表明 RhCaspase-7 可被RhCaspase-8 和RhCaspase-9 剪切，表明了RhCaspase-7 为效应Caspase 分子，而RhCaspase-8 和RhCaspase-9 为启始Caspase 分子。 四、RhATG5 调控蜱唾液腺退化过程中细胞自噬向细胞凋亡的转化 通过western blot 检测发现RhATG5 在蜱的吸血前期表达量低，后期表达量升高，与凋亡标 志分子一致。同时RhATG5 在蜱的吸血后期发生剪切。His-RhATG5 与μ-Calpain 共孵育，结果显 示RhATG5 在Ca2+存在的条件下可被μ-Calpain 剪切。体外培养的蜱的唾液腺组织中加入不同浓 度的20E ，高浓度的20E 处理后，导致蜱唾液腺中的Ca2+ 浓度和RhCalpains 的转录水平表达量 升高，RhATG5 裂解为NtRhATG5 ，自噬标志分子降低而凋亡标志分子表达量升高，促进了细胞 自噬向细胞凋亡转化。RhATG5 的体外RNAi 结果显示，唾液腺中的细胞自噬和细胞凋亡均被抑 制，证明RhATG5 对蜱的细胞自噬和细胞凋亡均有调节作用。上述结果表明，高浓度的20E 可通 过升高细胞内 Ca2+ 的浓度导致RhATG5 的剪切，并引起细胞自噬向细胞凋亡的转化，加快唾液 腺的退化进程。 I 五、宿主Beclin- 1 分子调控唾液腺退化过程中细胞自噬向细胞凋亡的转化 通过免疫荧光检测，发现宿主来源的Beclin- 1 出现在蜱唾液腺退化过程中，且其出现在蜱血 淋巴中的时间（吸血第5-7 天）要早于蜱唾液腺中（饱血后1-2 天）时间。蜱显微注射homo-Beclin- 1 重组蛋白可引起唾液腺的自噬和凋亡相关分子转录水平和TUNEL 染色阳性率的显著升高，与注 射20E 效果一致。同时注射Beclin- 1 和20E 后，蜱的唾液腺退化进程加快，而当加注自噬和凋亡 抑制剂后，自噬和凋亡相关因子转录水平明显降低。