蜱凋亡抑制蛋白IAP的鉴定和RNA干扰研究.pdfVIP

目 录 第一章 绪论 1 1.1 IAPS 的发现 1 1.2 IAPS 的蛋白结构 2 1.2.1 BIR 结构域 2 1.2.2 RING 指结构域 2 1.2.3 CARD 结构域 3 1.3 IAPS 的功能 3 1.3.1 IAPs 抑制细胞凋亡的作用 3 1.3.2 IAPs 在免疫中的作用 3 1.4 IAPS 在节肢动物中的研究进展和应用 4 1.4.1 果蝇 4 1.4.2 家蚕 5 1.4.3 蚊子 5 1.4.4 蜱 6 1.5 本研究的 目的和意义 6 第二章 蜱凋亡抑制蛋白（RhIAP ）基因的克隆 7 2.1 引言 7 2.2 实验材料 7 2.2.1 实验动物 7 2.2.2 实验试剂 7 2.2.3 主要仪器 8 2.3 实验方法 9 2.3.1 半饱血雌性成蜱唾液腺总 RNA 提取 9 2.3.2 RhIAP 全长基因的获取 9 2.4 结果 11 2.4.1 PCR 扩增 11 IV 2.4.2 RhIAP 基因序列分析 11 2.4.3 进化树分析 13 2.5 讨论 13 第三章 RhIAP 分子的基因转录水平检测 15 3.1 引言 15 3.2 实验材料 15 3.2.1 材料 15 3.2.2 主要仪器 15 3.3 实验方法 15 3.3.1 镰形扇头蜱不同发育阶段及组织器官的总 RNA 提取 15 3.3.2 实时定量 PCR 检测 16 3.4 结果 17 3.4.1 RhIAP 分子在蜱不同发育阶段的基因转录水平检测 17 3.4.2 RhIAP 分子在蜱不同组织器官的基因转录水平检测 17 3.4.3 唾液腺中 RhIAP 分子在不同吸血时期的基因转录水平检测 18 3.5 讨论 19 第四章 RhIAP 分子的原核表达和抗体制备 20 4.1 引言 20 4.2 实验材料 20 4.2.1 材料 20 4.2.2 主要仪器 22 4.3 实验方法 22 4.3.1 在原核表达系统 中表达纯化 RhIAP 蛋白 22 4.3.2 RhIAP 多克隆抗体制备 25 4.4 结果 26 4.4.1 RhIAP 重组蛋白表达纯化 26 4.4.2 多肽抗体识别唾液腺中的天然 RhIAP 26 4.5 讨论 27 V 第五章 RhIAP 分子的 RNA 干扰和功能鉴定 28 5.1 引言 28 5.2 实验材料 28 5.2.1 主要试剂 28 5.2.2 主要仪器 29 5.3 实验方法 30 5.3.1 双链 RNA 的合成 30 5.3.2 体外干扰 31 5.3.3 体内干扰 31 5.3.4 RhIAP 重组蛋白与 RhCaspase 体外结合 32 5.4 结果 33 5.4.1 双链 RNA 的合成 33 5.4.2 体外培养唾液腺干扰效果 33 5.4.3 体内干扰效果 35 5.4.4 蛋白结合实验 35 5.5 讨论 36 第六章 全文结论 38 参考文献 39