鸟氨酸氨基转移酶编码基因TaOAT的克隆及其与AtOAT基因在小麦中的功能分析.pdfVIP

摘 要 小麦是全球最重要的粮食作物之一，但小麦的产量却因环境胁迫的不断加重而倍受影响。 因此，挖掘小麦抗逆基因资源对于提高小麦耐盐和抗旱能力非常必要。对生物胁迫和非生物胁 迫的一个常见应对是脯氨酸(Pro) 的积累。鸟氨酸氨基转移酶(OAT)又称为 δ-鸟氨酸氨基转移酶 (δOAT), 是一种依赖于吡哆醛磷酸盐（PLP ）的酶，参与鸟氨酸与谷氨酰 5-半醛(GSA) 的转换。 鸟氨酸氨基转移酶是一种高度保守的酶，在脯氨酸(Pro)生物合成过程中催化鸟氨酸(Orn)转氨化 为 5-半醛(GSA)。该酶通过参与鸟氨酸途径，在逆境胁迫下植物产生的脯氨酸积累、细胞程序化 死亡和非宿主疾病抗性中发挥作用。迄今为止，OAT 基因已在水稻、玉米和高粱等植物中克隆 并进行了功能鉴定，但在小麦中还没有关于OAT 基因的研究。本研究拟对小麦中的OAT 基因进 行克隆和分子鉴定，并在小麦中分别对TaOAT 和AtOAT 基因进行功能分析。研究结果对于挖掘 耐环境胁迫的基因资源和培育抗逆小麦新品种具有重要理论和实践意义。主要研究结果如下： 1）通过生物信息分析、PCR 扩增和测序验证等手段，在小麦第 5 部分同源群染色体上共鉴 定了 3 个 TaOAT 同源基因，分别为TaOAT-5AL、TaOAT-5BL 和 TaOAT-5DL 。进一步对这3 个 基因 gDNA 序列与其对应的 cDNA 序列进行比对，发现 TaOAT 基因有 10 个外显子和 9 个内含 子。同时发现，TaOAT-5AL 存在 2 种类型的转录本，其中一个转录本在第 9 外显子和第 8 内含 子之间出现了中断基因表达的序列结构。 2 ）构建 OAT 系统进化树结果表明，OAT 在原核生物和真核动植物之间高度保守。在真核 植物中，OAT 明显形成了2 个群体，一组为单子叶植物，另一组为双子叶植物。利用 WebLogo 生成序列徽标分析法，进一步证实了 OAT 在植物之间的保守性。亚细胞定位分析显示，OAT 在 线粒体中发挥作用。蛋白质互作分析表明，TaOAT 通过与 1-δ-吡咯啉-5-羧酸酯合成酶(P5CS), 吡 咯啉-5-羧酸酯还原酶（P5CR ）和精氨酸酶(ARG)等编码基因相互作用在脯氨酸生物合成和氮再 利用中发挥作用。启动子分析显示 OAT 有多种胁迫响应元件存在，如脱落酸响应元件(ABRE)、 原粒细胞增多症(MYB)顺式元件、ROS 相关基序(G-box 和 W-box) 、乙烯响应元件(ERE)、热激 元件、类APETALA2(AP-2-like)元件和低温响应（LTR ）元件，表明这些胁迫响应元件参与了胁 迫调节。利用实时定量 PCR(Quantitative real-time PCR ，qPCR)对小麦植株分别在 50 ％PEG 和 200mM NaCl 胁迫条件下的基因表达分析显示，TaOAT 高度诱导表达。与旱敏感型品种相比， 其表达在抗旱型品种中高度上调。AP-2 类顺式作用元件的存在表明其在小花发育中可能发挥作 用。在抽穗期的雄蕊中观察到TaOAT 的表达上调，这表明其在花药裂开中存在发挥作用。 3 ）利用农杆菌转化法将 TaOAT-5BL 在小麦中进行了过表达，对转基因植株及其后代进行 了Bar 试纸条和 PCR 检测，获得了稳定转基因株系。半定量RT-PCR 结果显示，转基因株系中 TaOAT-5BL 表达量显著高于对照。将转基因株系和对照的成熟胚分别接种于含 150mM NaCI 培 养基上进行抗盐性鉴定，发现转基因株系萌发率（71-85%）显著高于对照（27% ）。盐胁迫 30 天后存活率调查显示，转基因植株存活率（35-40% ）显著高于野生型（12%）。同时，对转基 因株系幼苗从三叶期开始进行水分胁迫处理，旱胁迫处理后 17 天发现对照植株的生长受到严重 影响，而转基因株系生长正常。游离脯氨酸含量分析结果表明，正常条件下转基因植株脯氨酸 含量与野生型没有差异，干旱胁迫条件下转基因株系比野生型植物积累了更多的脯氨酸。 I 4 ）为了进一步解析 OAT 酶的功能，利用农杆菌介导法将拟南芥AtOAT 基因分别转入旱敏 感小麦品种 Fielder 和旱耐受型品种宁春 4 号。通过单倍体技术获得了纯合稳定转基因株系，经 过染色体原位杂交等分子鉴定，从 2 类转基因植株中各选择 3 个稳定转基因株系对其中的 AtOAT 基因进行功能分