奶牛瘤胃中活性尿素分解菌群多样性分析.pdfVIP

摘 要 瘤胃尿素分解菌分泌的脲酶可以水解尿素为氨，氨可被微生物吸收利用，合成微生物蛋白， 所以尿素分解菌在尿素氮循环中发挥关键作用。基于体外培养和以gDNA 为靶标的测序技术已经 对瘤胃尿素分解菌群多样性进行了探究，但是，这些结果仅解决了瘤胃中存在哪些尿素分解菌的 问题，而没有阐明正在发挥功能的活性尿素分解菌群及其多样性。本研究的目的是基于RNA 测 序揭示瘤胃中具有活性的尿素分解菌群多样性。 为了从瘤胃微生物中提取高质量的 RNA ，本研究对样品前处理方法进行了优化。试验共优 化四个前处理条件：瘤胃液样品形式、样品保存形式、解冻处理和研磨温度，组合形成五个处理 组：（1）微生物菌体加RNA 保护液液氮冷冻研磨、（2 ）微生物菌体液氮保存液氮冷冻研磨、（3 ） 微生物菌体液氮保存常温研磨、（4 ）瘤胃内容物液氮保存液氮冷冻研磨、（5 ）瘤胃内容物液氮保 存解冻收集菌体液氮冷冻研磨。每组设置3 个重复，检测RNA 浓度和完整度（RIN ）。结果表明， 瘤胃液样品形式对RNA 浓度和RIN 差异不显著；液氮保存的样品提取的RNA 浓度和RIN 均显 著高于RNA 保护液保存的样品；解冻处理对RNA 浓度差异不显著，但是会降低RIN ；研磨温度 对RIN 没有显著差异，但是冷冻研磨提取的RNA 浓度显著高于常温研磨。 为了分析瘤胃中具有活性的尿素分解菌群多样性，在晨饲后0，2 和6 h，采集4 头干奶期瘘 管荷斯坦奶牛瘤胃液，提取瘤胃液DNA 和RNA ，去除RNA 中gDNA 污染，得到纯净的RNA 反转录为cDNA 。利用ureC 引物对DNA 和cDNA 进行PCR 扩增并测序，利用QIIME 软件进行 序列质量控制、物种注释、OTU 分型以及多样性分析。结果表明，DNA 序列中约50% ureC 基因 无法在门水平注释到已有物种，cDNA 中这一数值为43%，表明瘤胃中栖息着大量新的、未知尿 素分解菌。采样时间对DNA 和cDNA ureC 基因的α 和β 多样性无显著差异。cDNA 中ureC 基因 Shannon 指数大于DNA (P 0.05) 。cDNA 与DNA UreC 基因的β 多样性有显著性差异(P 0.01) 。 瘤胃中高活性的尿素分解菌在属水平上主要分布在幽门螺杆菌属（Helicobacter ）、草螺菌属 （Herbaspirillum ）、梭菌属（clostridium ）、芽孢杆菌属（Paenibacillus ）、聚球藻菌属（Synechococcus ） 和鞘氨醇杆菌属 （Sphingobacterium ）。从ureC 基因OTUs 的变化可以看出，DNA 和cDNA 之间 高丰度的尿素分解菌是相似的，差异主要发生在低丰度的菌属。 本研究建立了提取高质量瘤胃微生物RNA 的前处理方法，揭示了瘤胃中具有活性的尿素分 解菌群多样性特征，为调控瘤胃尿素氮利用效率提供了理论依据。 关键词：瘤胃，尿素分解菌，活性，丰富度，多样性 III Abstract Ureolytic bacteria produce urease which hydrolyzes urea to ammonia, and the ammonia is an important N source for microbial growth and reproduction in rumen. Therefore, Ureolytic bacteria play a key role in the urea nitrogen cycle. The diversity of ureolytic bacteria have been explored based on in vitro culture and at gDNA level. However, there is no information at the RNA level which reflects the active status of bacteria. The purpose of this study was to reveal the diversity of active ureolytic bacteria in rumen.