氯硝柳胺与肉豆蔻木脂素抗弓形虫活性及机理.pdfVIP

摘 要 弓形虫是一种专性的胞内寄生原虫，可以感染包括人在内的所有温血动物。目前，弓形虫病 治疗缺乏有效的药物，急需开发具有抗弓形虫活性的化学药物。本试验选取了一系列可能具有抗 寄生虫活性的化合物，进行体外抗弓形虫活性筛选，对筛选出的活性化合物进行体内外抗虫活性 研究，并初步探究活性化合物的抗弓形虫机理。 化合物的体外抗虫活性与有效候选化合物筛选。采用 MTT 法，初步测定了不同浓度下化合 物对人包皮成纤维细胞（HFF ）的细胞毒性，并在最大的安全浓度下进行了化合物体外抗虫活性 筛选，结果显示，氯硝柳胺和肉豆蔻木脂素具有较强的抗弓形虫活性，可作为有效候选化合物进 行进一步研究。 氯硝柳胺的抗弓形虫活性及作用机理研究。采用荧光定量PCR 法和Giemsa 染色法评价氯硝 柳胺的体外抗弓形虫活性，结果显示，氯硝柳胺能抑制弓形虫的入侵和增殖，对弓形虫的半数抑 制浓度（EC50 ）为45.3 ng/mL 。试验建立了弓形虫感染Balb/c 小鼠的急性感染模型，采用氯硝柳 胺口服灌胃的方式给药，结果表明在240 mg/kg 的剂量下，小鼠死亡保护率达到50%，并且可以 降低小鼠组织器官及血液中的虫体荷载量。通过扫描电镜和透射电镜观察氯硝柳胺孵育后对弓形 虫超微结构产生的影响，发现氯硝柳胺引起弓形虫表面皱缩，内部线粒体肿胀。采用JC-1 荧光探 针检测发现氯硝柳胺可引起弓形虫线粒体膜电位的下降。同时，弓形虫的ATP 水平显著下降。为 了进一步探究氯硝柳胺的作用机制，采用转录组学和表面等离子共振分析研究，结果提示氯硝柳 + 胺可能影响弓形虫空泡型H ATPase （V-ATPase ）的质子转运，吖啶橙染色验证了氯硝柳胺导致弓 形虫体内的pH 失衡，流式细胞仪分析显示氯硝柳胺引起弓形虫死亡，且呈现剂量依赖性。 肉豆蔻木脂素的抗弓形虫活性及作用机理研究。采用 CCK-8 法检测了肉豆蔻木脂素对绿猴 肾细胞（Vero ）的细胞毒性，结果表明在132 μg/mL 剂量以下，肉豆蔻木脂素对Vero 细胞没有细 胞毒性。肉豆蔻木脂素在20～90 μg/mL 的浓度范围内，可显著降低弓形虫的入侵和增值，半数抑 制浓度为32.41 μg/mL 。在弓形虫感染Balb/c 小鼠的急性感染模型中，肉豆蔻木脂素采用腹腔注 射方式给药，显著降低了Balb/c 小鼠的组织中的弓形虫荷载量 （P 0.01 ）。采用扫描电镜和透射 电镜观察肉豆蔻木脂素对弓形虫超微结构的影响，结果显示肉豆蔻木脂素孵育后，引起弓形虫速 殖子表面形变和线粒体肿胀、变形和脊结构破坏，并有类似自噬的双层膜结构产生。采用 MitoTracker Red CMXRos 探针验证了肉豆蔻木脂素孵育后虫体线粒体膜电位的下降，同时，ATP 水平下降。MDC 染色显示肉豆蔻木脂素引起了弓形虫的自噬，且自噬基因在mRNA 水平和蛋白 水平的表达量显著增加。 研究证明，氯硝柳胺和肉豆蔻木脂素具有较好的体内外抗弓形虫活性。氯硝柳胺可能通过影 响V-ATPase 的质子转运，破坏弓形虫体内的pH 稳态，导致虫体死亡。肉豆蔻木脂素可能通过损 伤弓形虫线粒体功能，引起弓形虫自噬，导致弓形虫死亡。试验结果表明氯硝柳胺和肉豆蔻木脂 素可作为抗弓形虫候选先导化合物，具有开发成为新的抗弓形虫治疗药物的潜在价值。 关键词：弓形虫，氯硝柳胺，肉豆蔻木脂素，质子转运，自噬 I Abstract Toxoplasma gondii (T. gondii) is an obligate intracellular parasite, which can infect all the warm blood animals including human beings. To date, the current treatment drugs have many limitations, safe and effective drugs for the treatment of toxoplasmosis are urgently needed. In this study, a series of potential compounds which may