蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）致病基因的CRISPR、CRISPR_Cas9编辑及致病机理研究.pdfVIP

摘 要 蜜蜂是一种高度社会化的昆虫，具有很高的经济价值和生态作用。 目前，由于营养不足、自然栖息地的丧失、螨虫的侵袭、遗传多样性的 丧失、杀虫剂和特异的疾病等原因，全世界饲养的蜜蜂蜂群正面临着严 重的威胁，蜂群数量正在急剧下降。白垩病是由昆虫病原真菌蜜蜂球囊 菌(Ascosphaera apis) 引起的一种世界性的蜜蜂病害，也是造成全世界， 尤其是中国养蜂业重大损失的重要原因。由于白垩病引起蜂群数量的大 量减少，以及随之带来的巨大经济损失，研究人员开始寻找防治蜜蜂疾 病的新策略，其中包括对致病菌致病机制的分子生物学研究。目前，基 因工程技术是该研究的首选技术手段，即通过发现致病基因可能的作用 机制，对白垩病进行生物防控。基于此，根据实验室的前期工作基础， 本研究采取CRISPR/Cas9 基因编辑技术对蜜蜂球囊菌的4 个基因功能进 行了研究，为今后开发防控蜜蜂白垩病新方法，提高蜜蜂的健康水平奠 定基础。主要研究结果： 1.从中国 3 个省的 4 个不同蜂场收集了蜜蜂球囊菌菌株 4 个，采用 ITS 序列测序方法验证了物种特异性，梯度培养的方法明确了蜜蜂球囊 菌菌株对潮霉素B 的敏感浓度为25 µg/ml 。 2.在前期研究的基础上，选择了 4 个与蜜蜂球囊菌致病相关基因进 行了功能验证。包括：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合蛋 白基因 (Nicotinamide Adenine Dinucleotide binding protein , NAD (P)) 、杂色曲霉素 A 还原酶基因( Versicolorin reductase, StcU-2), 杂色曲霉素8-O- 甲基转移酶 基因(Sterigmatocytin 8-O-methyl transferase, OmtA) 以及超级杀伤蛋基因 (Super killer protein 3, Ski3) 。根据前间区序邻近基序设计并合成了相关基 因的sgRNA 引物。 3.优化了蜜蜂球囊菌原生质体再生条件。获得了原生质体最优制备 条件为：以培养 24 h 的蜜蜂球囊菌纯孢子、马铃薯葡萄糖肉汤培养基 (PIDB)培养24-36 h 获得的幼龄菌丝为材料，崩溃酶为消化酶，可获得更 7 -1 高质量的原生质体，原生质体产量约为6.71×10 mL ，再生率90% 。。 4.优化了蜜蜂球囊菌遗传转化条件。40% PEG4000 、1 mol/L 山梨醇 的STC 溶液介导原生质体转化，CRISPR/Cas9 的转化效率最高，选取的 I 4 个基因都获得了 100 个 (0.011%) 以上具有潮霉素B 抗性的原生质体转 化子。 5.采用潮霉素B 抗性筛选实验、激光扫描显微镜分析、CRISPR/Cas9 载体特异性标记EGFP 和hph 的PCR 检测以及测序等5 种方法对基因编 辑的结果进行了检验，结果表明，本实验获得了 2 个靶向基因 NAD (P) 和StcU-2 的14 个阳性转化子，从中各选取8 个突变株进行下一步分析。 6.发现蜜蜂球囊菌会因选取的前间区序列不同，以及转化介质浓度 不同而表现出不同的基因编辑结果。NAD (P)和 StcU-2 转化得到的蜜蜂 球囊菌突变体均表现出产孢功能明显下降，无功能的孢囊数量增多，推 测NAD (P)和StcU-2 两个基因与蜜蜂球囊菌的生殖发育相关。 7.对突变菌株的致病性进行了研究。结果表明，获得的突变株与初 发菌相比在致病指数及发病率上明显下降，差异极显著。 综上所述，本实验首次利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术对蜜蜂球囊 菌致病基因进行编辑，获得了突变体，为今后深入研究蜜蜂球囊菌致病 基因的功能，有效控制疾病，提供了参考依据。 关键词：蜜蜂球囊菌、致病基因、CRISPR/Cas9 基因编辑、白垩病 、原生质体再生 II Abstract Honeybees are high