猫传染性腹膜炎病毒抑制Ⅰ型干扰素通路分子机制研究.pdfVIP

摘 要 猫传染性腹膜炎（FIP ）是由猫传染性腹膜炎病毒（FIPV ）引起的，对家猫和野生猫科动物 可致死的重要传染病之一，约有5% 的家猫死于FIP 。FIPV 可以在单核细胞和巨噬细胞中有效且 持续性复制，致使感染的单核巨噬细胞激活，并造成全身性的感染。天然免疫系统利用模式识别 受体（PRRs ）对入侵病原体的病原相关分子模式（PAMPs ）进行识别，启动宿主抗病原微生物的 反应，诱导I 型干扰素和促炎性因子激活，进而抵抗病原微生物的感染。冠状病毒可以进化出多 种策略逃避宿主天然免疫应答。然而，FIPV 是否可获得拮抗I 型干扰素应答的能力以及免疫逃逸 分子机制的相关研究报道较少，本研究以FIPV 毒株DF2 作为研究对象，探究FIPV 对I 型干扰 素信号通路激活的抑制作用，揭示FIPV nsp5 阻断信号传递抑制IFN-β 应答的分子机制，可为FIPV 调控宿主 I 型干扰素免疫应答实现免疫逃逸的分子机制研究提供新思路，也为FIPV 致病机制的 研究和抗病毒药物和疫苗的研发提供科学支撑。 为了探究FIPV 感染宿主细胞后对I 型干扰素应答的影响，本研究利用双荧光素酶报告实验 和荧光定量PCR 对IFN-β 启动子活性水平和IFN-β 以及下游ISGs mRNA 进行了检测。结果显示， FIPV DF2 株感染CRFK 细胞后不能诱导IFN-β 应答和ISGs （Viperin，ISG15，IFITMI ）的表达， 反而能够抑制SeV 和poly(I:C)诱导的I 型干扰素通路的激活。机制研究显示，FIPV DF2 株感染 CRFK 细胞后剂量依赖性的抑制了SeV 和poly(I:C)诱导的IRF3 启动子活性的激活。此外，利用 Western blot 和激光共聚焦实验探索了FIPV DF2 株感染CRFK 细胞后对IRF3 的磷酸化水平以及 定位情况的影响。结果表明，FIPV DF2 株感染显著抑制了SeV 诱导的IRF3 的磷酸化，并且阻断 了SeV 诱导的IRF3 的核转运。综上所述，FIPV 感染可以通过拮抗IRF3 通路阻断I 型干扰素的 激活。 在已知的病毒免疫逃逸策略中，抑制干扰素信号通路中接头分子是一种普遍的逃逸手段。本 研究发现FIPV-nsp5 是RLR 介导的I 型干扰素通路的负调控因子。过表达FIPV-nsp5 可以显著抑 制SeV 或poly(I :C)诱导的I 型干扰素反应。进一步筛选发现FIPV-nsp5 通过靶向RLR 信号通路中 TBK1 的上游分子进而抑制 I 型干扰素信号转导。分子机制研究表明 FIPV-nsp5 切割接头分子 NEMO，导致后者功能丧失，进而抑制了I 型干扰素的激活；FIPV-nsp5 靶向NEMO Gln- 132， Gln-205 ，Gln-231 三个位点，而且FIPV nsp5 对NEMO 的切割依赖其3C 蛋白酶活性且不需要细 胞中凋亡相关降解途径的参与。此外，免疫共沉淀和磷酸化实验结果表明，FIPV-nsp5 对NEMO 的切割阻断了NEMO 对TANK 的招募，抑制了IRF3 的磷酸化，从而拮抗了RLR 介导的I 型干 扰素信号通路的激活。本研究揭示了 FIPV-nsp5 如何抑制宿主干扰素免疫应答从而导致FIPV 实 现免疫逃逸的分子机制，为猫传染性腹膜炎的科学防控提供了理论依据。 关键词：猫传染性腹膜炎病毒，Nsp5 ，I 型干扰素，NEMO，切割 I Abstract Feline infectious peritonitis (FIP), caused by feline infectious peritonitis virus (FIPV), is one of the leading infectious cause of death in wild and domestic cats. It kills approximately 5% cats in multi-cat households per year. FIPV causes systemic infection, effecti