表达新城疫病毒F蛋白传染性喉气管炎病毒gC缺失株的构建及评价.pdfVIP

摘 要 鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis ，ILT)是由鸡的传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus ，ILTV)引起鸡的一种急性上呼吸道病毒性疾病。该病的防控主要依靠疫苗 免疫，但是商品弱毒活疫苗存在毒力返强的问题，而表达 ILTV 免疫原基因的活载体疫苗有着免 疫起效时间长且保护不完全的缺点。ILTV 基因缺失疫苗具有弱毒活疫苗同样的免疫原性，同时 可以表达其他病毒抗原，有较好的应用前景。 新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) 引起的新城疫(Newcastle disease，ND)是禽的另外 一种烈性呼吸道传染病。该病遍布全世界，疫苗免疫是控制该病的主要措施。目前应用的活疫苗 虽然能够对所有的 NDV 强毒株感染提供临床保护，但是如果免疫鸡群感染其他基因型强毒株， 强毒株会在鸡体内的复制并排毒，造成生物安全隐患。中国目前流行的 NDV 主要是基因 VII 型 病毒，因此研发针对该型病毒的疫苗具有重要意义。 本研究以本实验室分离的 ILTV 弱毒株 ck/CH/LHLJ/120305(LHLJ/120305)作为亲本毒，采用 同源重组技术，首先利用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)替换 ILTV 的gC 蛋白基因，构建基因缺失株，命名为 ILTV-ΔgC-EGFP 。应用该毒株感染细胞后，在荧光显 微镜下可见明显绿色荧光，表明重组病毒感染细胞后可以有效表达外源蛋白。 本研究进一步以 ILTV-ΔgC-EGFP 株为基础，利用中国流行的 NDV VII 型 ck/CH/LHLJ/01/06 (LHLJ/01/06) F 蛋白基因替换 EGFP 基因，构建了一株表达 NDV F 蛋白的重组病毒，命名为 ILTV- ∆gC-F 株，并对重组病毒的生物学特性进行了研究。在此基础上，为了评价 ILTV-ΔgC-F 株的致 病性和免疫原性，将重组病毒人工接种无特定病原体(Specific pathogen-free，SPF)鸡，接种后 20d 未见临床症状，证明了 ILTV-ΔgC-F 株对 SPF 鸡无致病性，具有较好的安全性。通过酶联免疫吸 附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测 SPF 鸡抗体产生情况，结果表明重组病 毒可以诱导 SPF 鸡产生 ILTV 特异性血清抗体，抗体水平与亲本病毒 LHLJ/120305 基本一致。在 免疫后 21 d 用 ILTV WG 株攻毒后观察 20 d ，未见任何临床症状，ITPI 评分为 0 。应用荧光定量 PCR 检测攻毒后排毒和靶器官病毒复制情况，结果表明仅仅有少数的 SPF 鸡在感染早期检测到 呼吸道的病毒排毒和靶器官病毒复制，但对强毒 ILTV 的攻击提供了完全的临床保护作用。对免 疫鸡进行 NDV 抗体水平检测和 NDV 强毒株 LHLJ/01/06 的攻毒保护试验，应用rRT-PCR 检测攻 毒后排毒和靶器官病毒复制情况。结果表明，ILTV-ΔgC-F 株单次免疫后产生的 NDV 血清抗体水 平较低(40%) ，但是却能提供完全的临床保护。而且免疫组鸡咽肛拭子和靶器官中的病毒载量明 显低于对照组鸡。 综上所述，本次试验成功构建的 ILTV-ΔgC-F 株免疫 SPF 鸡可以抵抗 NDV 和 ILTV 强毒株的 攻击，ILTV-ΔgC-F 株可以作为 NDV 和 ILTV 二联活载体疫苗的候选毒株。在理论上可以同时区 分 NDV 和 ILTV 疫苗株和野毒株，具有区分感染动物和疫苗接种动物策略(Differentiating infected from vaccinated animals，DIVA)疫苗的功能。 关键词：传染性喉气管炎病毒，gC ，新城疫病毒，基因VII 型，二联候选疫苗 I