MiR-208b通过抑制Mettl8表达调控骨骼肌纤维类型转化.pdfVIP

摘 要 骨骼肌是动物肉类产品的主要来源，其主要的组成单位为肌纤维。成熟的骨骼肌纤维根据不 同的肌球蛋白重链亚型（Myosin heavy chain isoforms ，MyHC ）分为I、IIA 、IIB、IIX 四种不同类 型，分别由MyHC I （Myh7 ）、MyHC IIA （Myh2 ）、MyHC IIB （Myh4 ）和MyHC IIX （Myh1 ）标记， 不同类型肌纤维之间可以发生转化。本课题组前期发现MSTN （Myostatin ）基因编辑梅山猪的骨 骼肌中，I 型肌纤维减少，IIB 型肌纤维增多，且 miR-208b 表达量下调，靶基因 Mettl8 （Methyltransferase like 8 ）表达量上升，揭示其中存在一定联系。由于miRNA 的种子序列高度保 守，本研究以C2C12 成肌细胞和小鼠为对象，结合分子实验、细胞实验和动物模型的构建，旨在 探究miR-208b 靶向Mettl8 影响骨骼肌肌纤维类型转化中的分子机制。 本研究首先利用RT-qPCR （Real-time quantitative polymerase chain reaction ）和WB （Western Blot ）验证前期测序结果并探究miR-208b 和Mettl8 在梅山猪中的表达规律。接着以C2C12 细胞 成肌分化模拟肌纤维发育和成熟过程，通过转染miR-208b 模拟物和抑制剂探究miR-208b 在分化 过程在对不同类型肌纤维标志基因MyHC 的影响；利用生物信息学分析、双荧光素酶实验和分子 实验验证miR-208b 与Mettl8 的靶向关系，并通过C2C12 细胞中Mettl8 的干扰实验探究Mettl8 在 分化过程中对MyHC 表达的影响；最后构建miR-208b 和Mettl8 基因敲除小鼠模型，通过分子实 验、HE 染色等进一步探究miR-208b 和Mettl8 对肌纤维转化的影响。结果如下： （1）与MSTN +/+ （野生型）相比，miR-208b 和Mettl8 在MSTN-/- （双敲型）组表达量分别 显著下调和上调；miR-208b 在E65d （胚胎期65 天）梅山猪背最长肌和心脏中表达量较高； Mettl8 在梅山猪各组织中广泛表达。 （2 ）MiR-208b 在成肌分化过程中的变化趋势与慢肌纤维标记基因Myh7 一致；在C2C12 细胞中转染miR-208b 模拟物后，其表达量显著上升，且分化4 天后，过表达miR-208b 的细胞 中Myh4 在mRNA 和蛋白水平表达量均下降，Myh7 表达量均上升，抑制miR-208b 表达后则得 到相反的结果，表明miR-208b 可促进快肌纤维向慢肌纤维转化。 （3 ）通过生物信息学方法分析了miR-208b 与Mettl8 3’ UTR （Untranslated regions ）的结合 位点，并通过双荧光素酶实验、RT-qPCR 和WB 验证了Mettl8 与miR-208b 靶向关系；在 C2C12 细胞中转染Mettl8 siRNA （small interfering RNA，小干扰RNA ）后，通过mRNA 水平和 蛋白水平的检测发现，Mettl8 表达量显著下降，Myh7 表达量上升，Myh4 表达量下降，表明 Mettl8 可促进慢肌纤维向快肌纤维转化。 （4 ）成功构建、鉴定和繁育miR-208b 和Mettl8 基因敲除小鼠；肌纤维HE 染色结果发 现，与野生型相比，敲除小鼠腓肠肌单个肌细胞横切面大小发生了变化。通过RT-qPCR 检测小 鼠MyHC 和骨骼肌能量代谢相关基因表达，结果表明miR-208b 和Mettl8 在不同类型骨骼肌纤维 转化过程中发挥相反的作用，且可以通过影响肌纤维类型而影响骨骼肌能量代谢。 综上所述，miR-208b 可通过靶向抑制Mettl8 从而影响不同肌纤维类型的转化。 关键词：骨骼肌，肌纤维类型转化，miR-208b ，Mettl8 I Abstract Skeletal muscle is the main sour