冰城链霉菌米尔贝霉素合成后修饰基因功能研究及工程改造.pdfVIP

摘 要 米尔贝霉素A3/A4 及其衍生物作为环境友好型杀螨剂、驱虫剂被应用于农业和畜牧业中。冰 城链霉菌是重要的米尔贝霉素A3/A4 工业生产菌株，具有丰富的次级代谢物产生能力。在其发酵 培养过程中，除米尔贝霉素A3/A4 外，常伴随产生其它米尔贝霉素组分、南昌霉素、冰城霉素等 多种次级代谢产物。米尔贝霉素B1、B2 、α9、α10、β1、β2 及其它β 类米尔贝霉素组分由于在 化学结构和性质上与米尔贝霉素 A3/A4 相似，无法通过理化性质差异分离，增加了米尔贝霉素 A3/A4 的分离纯化难度。米尔贝霉素类副产物的生成竞争了米尔贝霉素A3/A4 的合成前体，降低 了米尔贝霉素A3/A4 的单位发酵产量，导致米尔贝霉素A3/A4 生产成本难以降低从而限制其广 泛应用。本课题组在前期研究中利用物理、化学诱变以及系列代谢工程改造等方法获得了米尔贝 霉素B1 、B2、β1、β2 等副产物消除的优良菌株，但是米尔贝霉素α9/α10 和β 类米尔贝霉素副产 物仍伴随米尔贝霉素A3/A4 产生。为了阻断或降低副产物米尔贝霉素α9/α10 和β 类米尔贝霉素 的生物合成，进一步优化米尔贝霉素A3/A4 生产菌株，本研究探索了参与米尔贝霉素α9/α10 和β 类米尔贝霉素生物合成过程中的后修饰酶。 cyp41 （sbi_07711 ）编码一种细胞色素 P450 （CYP450 ）酶。Cyp41 是Nelson 细菌 CYP450 数据库中收录的唯一一个发现于链霉菌属CYP268 家族的蛋白。通过对cyp41 基因进行体内敲除、 回补和异源表达及体外投喂试验证明，Cyp41 能够催化米尔贝霉素A3/A4 的C26 位发生羟基化， 生成米尔贝霉素α9 和α10 的生物合成前体α26 和α27 。在冰城链霉菌BC04 中敲除cyp41 后得到 突变株B4DP ，发酵培养后经HPLC 检测发现米尔贝霉素α9/α10 组分不再生成，同时米尔贝霉素 A3/A4 产量从2382.5 mg/L 提高到2625.6 mg/L 。此外，本研究对属于CYP171 家族的蛋白MilE 进行了研究，通过体内敲除及回补和异源表达及体外投喂试验证明 MilE 负责米尔贝霉素C6-C8 间呋喃环的形成，催化β 类米尔贝霉素生成α类米尔贝霉素。在冰城链霉菌B4DP 中过表达milE 得到突变株BPSE ，与出发菌株相比，突变株BPSE 中β 类米尔贝霉素含量降低约77.2%，米尔 贝霉素A3/A4 产量提高约39.0% 。对突变株BPSE 进行qRT-PCR 检测发现米尔贝霉素生物合成关 键基因的转录水平均有所升高。同时对负责米尔贝霉素类化合物螺酮环形成的后修饰酶MilC 进 行初步研究，在BC04 中过表达milC 后突变株中米尔贝霉素A3/A4 单位发酵产量提高约13.5%。 基于上述研究结果，最后我们对高产菌株BC04 进行了基因工程改造，获得了优良菌株BPSEC ， 与出发菌株BC04 相比，其米尔贝霉素A3/A4 产量提高约57.69%，达到3727.21 mg/L 。 综上，本研究取得了以下成果：（1）首次发现并鉴定了负责米尔贝霉素A3/A4 的C26 位羟 基化的CYP450 酶；（2 ）首次发现过表达milE 可提高米尔贝霉素生物合成基因簇内关键基因的转 录水平；（3 ）获得了一株不产米尔贝霉素α9/α10、低产β 类米尔贝霉素而高产米尔贝霉素A3/A4 的菌株BPSEC ；（4 ）提出通过基因工程改造多个后修饰酶来提高米尔贝霉素A3/A4 产量并减少 副产物的策略。 关键词：冰城链霉菌，米尔贝霉素，细胞色素P450 ，基因工程改造 I Abstract Milbemycins and their semisynthetic derivatives are eco-friendly acaricides and pesticides, which are produced by Streptomyces bingchenggensis. Among the tens of secondary metabolites produced by Streptomyces bingchenggensis, several by-pr