表达禽β-防御素的重组乳酸菌作为免疫佐剂的研究.pdfVIP

摘 要 益生乳酸菌（Lactic acid bacteria ，LAB ）菌体较大，不存在内毒素，可以吸附黏膜细胞上并 定居于黏膜表层。因此，乳酸菌是表达和传递治疗性和预防性外源蛋白的首选载体。禽β-防御素 （AvBDs ）是主要存在于天然黏膜系统的天然抗菌肽之一，主要发挥抗感染、广谱抗菌和广泛的 免疫调节作用，特别是禽β-防御素是一种小的阳离子非糖基化的多肽，非常适合于原核表达。因 此，本研究采用食品级乳酸乳球菌 NZ3900 宿主菌株，构建了完全食品级表达禽 β-防御素的重 组乳酸菌。 本研究利用3 种表达质粒和食品级宿主菌株构建了3 套表达禽β-防御素的重组乳酸菌。采用 的3 种表达系统和食品级乳酸乳球菌 NZ3900 菌株作为宿主菌株，分别构建了表达禽β-防御素1 （AvBD1 ）、禽β-防御素2 （AvBD2 ）、禽β-防御素6 （AvBD6 ）、禽β-防御素13 （AvBD13 ）和融 合禽β-防御素1/2/6/13 功能片段组成的融合禽β-防御素AvBD12613 ，共 11 株重组乳酸菌，其中 5 株重组乳酸菌的表达量稳定，蛋白大小正确，是本研究用于体外筛选和体内动物试验验证的重 组乳酸菌。 利用表达β-防御素的重组乳酸菌的菌体裂解混合物体与巨噬细胞、外周血单个核细胞等的相 互作用，对构建的重组乳酸菌体外免疫调节活性的检测，体外筛选试验结果表明，表达禽β-防御 素的重组乳酸菌 r-L. Lactis-AvBD12613 菌体裂解混合物可以显著激活巨噬细胞报告细胞系 J774-Dual™细胞的IRF 及NF-κB 信号通路； 5 种表达重组禽β-防御素rAvBD1 、rAvBD2 、 rAvBD6 、 rAvBD13 及rAvBD12613 重组乳酸菌菌体裂解混合物均能够诱导鸡巨噬细胞系HD11 产生较高水 平的IL-10；其中rAvBD12613 还能够诱导HD11 表达较高水平的CD80 和CD86 分子；而重组禽 β-防御素rAvBD12613 、rAvBD1 及rAvBD6 能够诱导鸡外周血单个核细胞（PBMCs ）产生较高 水平的IL-12 与IL-10；并且rAvBD12613 还能诱导鸡PBMCs 表达较高水平的CD80 和CD86 分 子，体外筛选表明，表达重组禽β-防御素rAvBD12613 重组乳酸菌具有较强的免疫调节活性。 利用表达组合禽β-防御素rAvBD12613 重组乳酸菌的菌体裂解混合物作为新城疫活疫苗和新 城疫灭活疫苗的免疫佐剂，通过检测血清中细胞因子表达水平，PBMCs 和外周血白细胞的增殖 活性以及抗体水平等方式来验证组合禽β-防御素rAvBD12613 的免疫佐剂活性。动物实验结果表 明：在重组禽β-防御素rAvBD12613 免疫佐剂活疫苗试验中，注射免疫1 周后，显著提高了实验 组鸡血清中IL-4 和IL-1β 表达水平，而IL-10 和IFN-γ 在血清中的表达水平差异不显著；与野生 菌对照组和活疫苗对照组相比，在免疫3 周攻毒 1 周后，显著提高了实验组的抗体水平；免疫3 周及攻毒1 周后，极显著提高了实验组鸡PBMCs 的增殖活性；免疫1 周及攻毒1 周后，显著提 高了实验组鸡PBMCs 的增殖活性。而在鸡新城疫重组禽β-防御素rAvBD12613 免疫佐剂油乳剂 灭活疫苗试验中，在免疫3 周攻毒 1 周后，可以显著提高实验组的抗体水平；免疫3 周及攻毒 1 周后，可以显著提高实验组鸡PBMCs 和白细胞的增殖活性，显著高于灭活疫苗对照组。结果表 明，重组禽β-防御素rAvBD12613 免疫佐剂在新城疫活疫苗和灭活疫苗试验中均具有较好的免疫 佐剂活性。 本研究构建表达的重组禽β-防御素rAvBD12613 在体内外均显示了较强的免疫调节活性，具 I 有作为免疫佐剂或免疫增强剂的潜力，为新型食品安全级动物免疫佐剂或免疫增强剂的研发奠定 了基础。 关键词：重组乳酸菌，禽β-防御素，免疫调节活性，免疫佐剂，免疫增强剂 II Abstract Probiotic lactic acid bacteria (LAB) are large, without endotoxin, c