用于多联疫苗制备的猪链球菌表面递呈系统的开发.pdfVIP

摘 要 革兰氏阳性的猪链球菌 （Streptococcus suis）是一种严重危害养猪业发展和人类健康的重要 人兽共患病原菌，临床上常出现多种血清型、多种病原体混合或继发感染。因此，开发猪链球菌 多联疫苗，对于预防混合感染、减轻猪场免疫负担具有重要意义。通过表面递呈将异源抗原递呈 在细菌表面，是一种极具潜力的多联疫苗制备途径，但是目前还没有猪链球菌表面递呈外源蛋白 的报道。根据革兰氏阳性细菌LPxTG 蛋白的表面锚定原理，将LPxTG 蛋白转运和锚定信号与外 源蛋白融合，希望能够实现在革兰氏阳性细菌表面递呈外源蛋白，从而为开发猪链球菌多联疫苗 提供了一种新思路。 为了构建猪链球菌的蛋白表面递呈系统，本研究通过序列分析，鉴定获得猪链球菌2 型 05ZYH33 菌株的LPxTG 蛋白及其信号肽 （SP）和胞壁锚定基序 （CWA）。通过扩增P -SP、 eno GFP、CWA 的DNA 片段并融合，构建强启动子P 控制表达编码SP-GFP-CWA 融合蛋白的DNA eno 片段。将该重组DNA 片段连入pSET2 载体，获得蛋白表面递呈质粒，转化猪链球菌05ZYH33， 构建以GFP 为报告蛋白的猪链球菌蛋白表面递呈系统，采用WesternBlot，初步观察递呈蛋白情 况。结果显示，鉴定了猪链球菌的10 个LPxTG 蛋白及其SP 和CWA 序列，构建了10 个含有 P -SP-GFP-CWA 融合片段的重组pSET2 表面蛋白递呈质粒pSsPSD1至pSsPSD10，其中7 个成 eno 功转化了猪链球菌，均能有效表达GFP 蛋白，以成熟GFP 条带为指标，均表现出了一定的外源 GFP 表面递呈水平，说明猪链球菌蛋白表面递呈系统构建成功，分别命名为SsPSD1、SsPSD2、 SsPSD4、SsPSD7-SsPSD10，其中SsPSD1、SsPSD2、SsPSD8和SsPSD9表面递呈水平或潜力相 对较好。 为了进一步证实分选酶A （SrtA）在猪链球菌LPxTG 蛋白加工中的作用，本研究通过构建 Δ Δ srtA 基因缺失菌株（srtA ），并将pSsPSD4 质粒转化05ZYH33野生（WT）菌株和05ZYH33srtA Δ Δ 菌株，构建SsPSD4-WT 和SsPSD4-srtA 菌株。分别提取SsPSD4-WT 和SsPSD4-srtA 菌株的菌 体总蛋白，采用Western Blot 分析方法，比较两个菌株产生的GFP 蛋白的状态。结果显示， SsPSD4-WT 中存在3 种GFP 状态，即GFP 前体蛋白、GFP 中间体蛋白和GFP 成熟蛋白，而 Δ SsPSD4-srtA 菌株中没有SrtA 的表达，只产生GFP 前体蛋白和GFP 中间体蛋白，而不产生GFP 成熟蛋白，说明GFP 成熟蛋白确实来自于SrtA 的加工。 本研究首次尝试利用LPxTG 蛋白的锚定原理建立猪链球菌的蛋白表面递呈系统，为猪链球 菌表面递呈外源蛋白或抗原提供了新的策略。 关键词：猪链球菌，蛋白表面递呈，LPxTG，信号肽，胞壁锚定基序 I Abstract Gram-positive Streptococcus suis is an important zoonotic pathogen that seriously endangers the development of the pig industry and human health. It often appears clinically with multiple serotypes, multiple pathogens mixed or secondary infections. Therefore